我在 2017 年或者更早，就搭建了自己的独立博客，那时主要写一些随笔，更的很少很慢。研究生和工作之后，开始转向写一些技术内容，当然了，主要是一些学习笔记，毕竟我还没有到能独立输出知识的地步。同时博客的更新频率也相对多了些。一方面，我关注的方向比较多，涉猎广泛杂乱；另一方面，我逐渐养成整理知识体系的习惯，并使用了一些 Markdown 类的管理工具，方便转成博客。

属于独立博客的时代已经过去了。我所坚持的似乎是一件很老套的事情，就如同在精心维护一片野花园，却处在偏远山中，少有人游览。但我觉得呢，那些花儿本身，就值得被栽种盛开。

我想，写博客的目的，首先是记录。“那些很渺小的东西，都是我人生的大事。”我始终保持对文字的敬畏，我们应该记录和表达一些东西。只可惜，我好像能静下来思考的时间越来越少，我好久没能写一篇完整的随笔。

其次，写博客的目的是共享。我很乐意分享我学习和总结到的一些东西，并期待在提供帮助的同时，也能收到一些反馈。从后台统计看，我很高兴一些内容似乎帮助到了某些陌生人，至少，对 AI 起了帮助。

此外，我认为比无知更可怕的是误解。我担心在传递这些内容的同时，由于我的不足也传递了谬误。所以，亲爱的陌生人，如果您有任何的疑问，请一定不要吝惜与我交流（ jiangshen@outlook.com ）。

转膜

材料

• 转印缓冲液（含有 20% 甲醇的 1X Tris-甘氨酸缓冲液）

甲醇能减少凝胶的膨胀并提高蛋白质与硝酸纤维素膜的结合效率。转膜效率受以下因素影响：电泳缓冲液中是否存在 SDS、转膜缓冲液的 pH 及转膜前凝胶中的蛋白质是否已染色。为最大限度地提高转膜效率，SDS 的浓度不应超过 0.1%，转膜缓冲液 pH 必须 ≥8.0。

SDS-PAGE 凝胶制备

材料

• 30% 丙烯酰胺/N,N'-亚甲基双丙烯酰胺混合液（29∶1, m/m）
• 10% 过硫酸铵（APS, m/V）
• 10% SDS 溶液
• 四甲基乙二胺（TEMED）
• 1.5 M Tris-HCl（pH8.8）
• 1.0 M Tris-HCl（pH6.8）
• 去离子水
• 异丙醇（或 70% 乙醇或水饱和丁醇）

设备

• 垂直电泳槽

细胞裂解和蛋白提取

材料

• 哺乳动物悬浮或单层生长的细胞样品或组织样品
• 裂解缓冲试剂
• 蛋白酶抑制剂 Cocktail
• 磷酸酶抑制剂 Cocktail

设备

• 高效匀浆器（匀浆组织时选用）
• 高速冷冻离心机

总 RNA 提取

材料

• 悬浮或单层生长的细胞样品或组织样品
• 氯仿或1-溴-3-氯丙烷（氯仿，品牌：Greagent，型号/货号：G75915B）

溴氯丙烷是一种可取的氯仿替代物，因为它毒性更小且不易挥发。此外，溴氯丙烷可以提供更好的液相分离，从而更好地从总 RNA 中去除基因组 DNA，获得更纯的 RNA。

• 异丙醇（异丙醇，品牌：Greagent，型号/货号：G75885B）
• 糖原（20 mg/mL 储存液）（可选）
• 无 RNase 的水（DEPC 水，品牌：Beyotime，型号/货号：R0022）
• 乙醇（无水乙醇，品牌：Greagent，型号/货号：G73537AC）
• 75% 乙醇（用无水乙醇和 DEPC 水配制）
• 单相裂解试剂（如 TRIzol）（TriQuick Reagent 总 RNA 提取试剂，品牌：Solarbio，型号/货号：R1100）
• 磷酸盐缓冲液（PBS）（1X）（PBS 缓冲液，品牌：Solarbio，型号/货号：P1020）

1. 每周更新一篇推文，保持写作和记录习惯；
2. 合理安排时间，早睡早起，每周至少 4 天在 24:00 前睡觉；
3. 必须参加 IELTS，并 ≥ 7.0；
4. 对专业知识有系统的了解，对相关法规有较全面的认识；
5. 锻炼，控制 BMI ≤ 22.0；
6. 系统学习摄影知识；
7. “宁可痛苦，不要麻木”，常留点时间思考，静下心来看几本书和几部电影；
8. 多向外索取，表达是方式，而不是目的；
9. 及时行动，勇敢不要犹豫。

实验动物相关生理参数

Table 1. Relevant physiological parameters for different animals¹

不同途径推荐给药体积

Table 2. Recommended Dose Volumes for Common Laboratory Animals²

数据要求

1. 反应结束后需要确认扩增曲线及熔解曲线，标准扩增曲线为 S 型，熔解曲线呈单峰；

2. Ct 值介于 20–30 之间时，定量分析最准确；Ct 值小于 10 时，需要将稀释模板后，重新进行实验；Ct 值介于 30–35 之间时，需要提高模板浓度，或者增大反应体系的体积，以提高扩增效率，保证结果分析的准确性；Ct 值大于 35 时，检测结果无法定量分析基因的表达量，但可用于定性分析。

3. 定量实验至少需要三个生物学重复；所有复孔间的差别应该在 0.5 Ct 内；在 35 个循环以后，Ct 值变化较大，定量结果可能不太可靠。

标准扩增曲线为 S 型，如下图：

PCR 前期，目的 DNA 以指数形式扩增，这一扩增时期称为指数期（Exponential phase）；PCR 后期，由于引物和 dNTP 等反应底物的减少，目的 DNA 片段扩增的速度变慢，直至停止，这一扩增时期称为平台期（Plateau phase）。qPCR 过程中，荧光值随着目的 DNA 的扩增而增加，当荧光值达到阈值时的循环数称为 Ct 值，Ct 值越小，说明目的 DNA 的初始浓度越大。

反转录

材料

• 已测定浓度的总 RNA 样品
• PrimeScript™ RT Master Mix (Perfect Real Time)（品牌：TaKaRa，型号/货号：RR036A）

It contains a 5X pre-mixed reagent containing all of the components needed for quantitative RT-PCR reverse transcription (PrimeScript RTase, RNase Inhibitor, Random 6 mers, Oligo dT Primer, dNTP Mixture, and reaction buffer), and a reaction can be started simply by adding template RNA and water.

• RNase Free dH₂O（PrimeScript™ RT Master Mix 内置）
• 微量离心管（0.2 mL）（PCR 单管，品牌：A-gen，型号/货号：PCR-02）

RNA 定量

材料

• 适当稀释的总 RNA 样品
• 空白检测溶液（如 TE（pH 8.0）、无 RNase 的水等）
• 无尘纸

设备

• 微量分光光度计