酶促反应动力学

发表于 2025-07-18 更新于 2026-05-11 Waline：

酶动力学基本参数

米氏方程

1902 年 Victor Henri 提出了酶- 底物中间复合物学说，认为首先是酶 E 与底物 S 生成酶-底物中间复合物 ES，然后 ES 分解生成产物 P 和游离的酶。

$$ \ce{E + S <=>[k_1][k_2] ES ->[k_3] E + P} $$

式中的 k₁、k₂ 和 k₃ 分别为各向反应的速率常数。

1913 年 Leonor Michaelis 和 Maud Menten 根据酶-底物复合物学说，经过大量实验，得出表示酶促反应动力学基本原理的数学表达式，即单底物浓度 [S] 与酶反应速度 v 的定量关系，即著名的米-门二氏方程（Michaelis-Menten equation，也称米氏方程）。

$$ v = \frac{V_{max} [S]}{K_{m} + [S]} $$

v 指酶促反应的速率；
V_max 指酶促反应的最大反应速率；
K_m 是底物的米氏常数，$K_{m} = \frac{k_{2}+k_{3}}{k_{1}}$。

Figure 1. 底物浓度对酶促反应速率的影响

可知如下重要性质：

K_m 值等于酶促反应速率为最大反应速率一半时的底物浓度；
K_m 值是酶的特征性常数，K_m 值的大小并非固定不变，它与酶的结构、底物结构、反应环境的 pH、温度和离子强度有关，而与酶浓度无关；
K_m 在一定条件下可表示酶对底物的亲和力；
V_max 是酶被底物完全饱和时的反应速率。

酶动力学参数的测定

要测量 K_m 和 V_max 值，可以通过测量一系列不同底物浓度 [S] 及对应的初始反应速率 v，然后使用林-贝作图法（Lineweaver-Burk plot）或直接拟合进行求解。

Lineweaver-Burk plot

将米氏方程的两边同时取倒数，有：

$$\frac{1}{v}=\frac{K_{m}}{V_{\max}}\cdot\frac{1}{[\mathrm{S}]}+\frac{1}{V_{\max}}$$

以 $\frac{1}{v}$ 对 $\frac{1}{[S]}$ 作图，纵轴上的截距为 $\frac{1}{V_{max}}$，横轴上的截距为 $-\frac{1}{K_{m}}$，称为林-贝作图法（Lineweaver-Burk plot）。

Figure 2. 林-贝作图法（Lineweaver-Burk plot）

抑制常数

$$ \ce{E + I <=> EI} $$

抑制常数（Inhibitory constant, K_i）即抑制剂-酶复合 EI 解离为游离酶 E 和抑制剂 I 的解离常数‌，K_i 反应抑制剂与酶的亲和力强度，K_i 越小，表明抑制剂与酶的亲和力越强。

$$ K_i=\frac{[E][I]}{[EI]} $$

K_i 在一定条件下（如特定的温度、pH 和缓冲液体系等）是常数，而与酶浓度 [E] 和抑制剂浓度 [I] 无关，也与底物存在与否无关。

竞争性抑制

在竞争性抑制（Competitive Inhibition）中，抑制剂 I 与底物 S 竞争酶的同一个活性位点。抑制剂只能与游离的酶 E 结合，不能与酶-底物复合物 ES 结合。

所涉及的化学平衡如下：

$\ce{E + S <=> ES -> E + P}$
$\ce{E + I <=> EI}$

$$v = \frac{V_{max}[S]}{K_m \left( 1 + \frac{[I]}{K_i} \right) + [S]}$$

通过比较可以看出，竞争性抑制剂使表观米氏常数 K_m^app 增加了 $(1 + \frac{[I]}{K_i})$ 倍：

$$K_m^{app} = K_m \left( 1 + \frac{[I]}{K_i} \right)$$

，而 V_max 不变。

非竞争性抑制

在经典的非竞争性抑制（Non-competitive Inhibition）中，抑制剂 I 与底物 S 结合在酶的不同位点上。抑制剂既可以与游离酶 E 结合，也可以与酶-底物复合物 ES 结合，且结合能力相同。

所涉及的化学平衡如下：

$\ce{E + S <=> ES -> E + P}$
$\ce{E + I <=> EI}$ （解离常数为 K_i）
$\ce{ES + I <=> ESI}$ （解离常数为 K_i^′，且 K_i^′ = K_i）
$\ce{EI + S <=> ESI}$

$$v = \frac{\frac{V_{max}}{1 + \frac{[I]}{K_i}}[S]}{K_m + [S]}$$

在这种情况下，K_m 不变，而表观最大反应速度 V_max^app 降低了：

$$V_{max}^{app} = \frac{V_{max}}{1 + \frac{[I]}{K_i}}$$

反竞争性抑制

在反竞争性抑制（Uncompetitive Inhibition）中，抑制剂 I 只能与酶-底物复合物 ES 结合，形成无活性的 ESI 复合物。

所涉及的化学平衡如下：

$\ce{E + S <=> ES -> E + P}$
$\ce{ES + I <=> ESI}$ （解离常数为 K_i^′）

通过与竞争性抑制类似的代数变换，最终可以推导出反竞争性抑制下的米氏方程：

$$v = \frac{\frac{V_{max}}{1 + \frac{[I]}{K_i'}}[S]}{\frac{K_m}{1 + \frac{[I]}{K_i'}} + [S]}$$

在这种情况下，V_max 和 K_m 都受到了影响，它们都除以了同一个因子 $(1+\frac{[I]}{K_i'})$。

$$V_{max}^{app} = \frac{V_{max}}{1 + \frac{[I]}{K_i'}} \quad \text{and} \quad K_m^{app} = \frac{K_m}{1 + \frac{[I]}{K_i'}}$$

混合型抑制

在混合型抑制（Mixed Inhibition）中，抑制剂不仅可以与游离的酶 E 结合，也可以酶-底物复合物 ES 结合，且抑制剂与这两种形式的酶的亲和力不同。

所涉及的化学平衡如下：

$\ce{E + S <=> ES -> E + P}$
$\ce{E + I <=> EI}$ （解离常数为 K_i）
$\ce{ES + I <=> ESI}$ （解离常数为 K_i^′，且 K_i^′ ≠ K_i）
$\ce{EI + S <=> ESI}$

混合型抑制的米氏方程：

$$ v=\frac{V_{max}\cdot[S]}{K_m(1+\frac{[I]}{K_i})+[S](1+\frac{[I]}{K_i^{\prime}})} $$

假设：

K_i^′ = α ⋅ K_i

如果 α > 1，则 K_i^′ > K_i，表示抑制剂与游离酶的结合能力更强；
如果 α < 1，则 K_i^′ < K_i，表示抑制剂与酶-底物复合物的结合能力更强。

米氏方程整理为

$$v=\frac{V_{max}\cdot[S]}{K_m(1+\frac{[I]}{K_i})+[S](1+\frac{[I]}{\alpha K_i})}$$

表观最大反应速率 V_max^app：

$$V_{max}^{app}=\frac{V_{max}}{1+\frac{[I]}{K_i^{\prime}}}=\frac{V_{max}}{1+\frac{[I]}{\alpha K_i}}$$

由于抑制剂可以结合到 ES 复合物上形成无活性的 ESI 复合物，从而降低了有效催化复合物的浓度，因此表观最大反应速率 V_max^app 总是减小。

表观米氏常数 K_m^app：

$$K_m^{app}=K_m\frac{1+\frac{[I]}{K_i}}{1+\frac{[I]}{K_i^{\prime}}}=K_m\frac{1+\frac{[I]}{K_i}}{1+\frac{[I]}{\alpha K_i}}$$

K_m^app 的变化取决于抑制剂对 E 和 ES 的相对亲和力（即 α 的值）：

如果抑制剂优先结合游离酶（α > 1），则 K_m^app 增大（表观亲和力下降）。
如果抑制剂优先结合酶-底物复合物（α < 1），则 K_m^app 减小（表观亲和力上升）。

抑制常数的测量

基本思路

基本思路是，通过测量在不同底物浓度 [S] 和不同抑制剂浓度 [I] 条件下酶的反应速率 v，来观察抑制剂对酶动力学参数（V_max 和 K_m）的影响。

实验设计：设置一系列抑制剂浓度 [I]，每一个固定的抑制剂浓度下，再设置一系列底物浓度 [S] ，测量在不同底物浓度 [S] 和不同抑制剂浓度 [I] 条件下酶初始反应速率 v。

Table 1. 实验组设计示例

	[I]₀	[I]₁	[I]₂	[I]₃
[S]₁	v_1, 0	v_1, 1	v_1, 2	v_1, 3
[S]₂	v_2, 0	v_2, 1	v_2, 2	v_2, 3
[S]₃	v_3, 0	v_3, 1	v_3, 2	v_3, 3
[S]₄	v_4, 0	v_4, 1	v_4, 2	v_4, 3
[S]₅	v_5, 0	v_5, 1	v_5, 2	v_5, 3
[S]₆	v_6, 0	v_6, 1	v_6, 2	v_6, 3
[S]₇	v_7, 0	v_7, 1	v_7, 2	v_7, 3

结果分析

酶动力学参数

在不加抑制剂一组（[I] = 0）中，以不同底物浓度 [S] 及对应的初始反应速率 v，使用林-贝作图法（Lineweaver-Burk plot）或直接拟合进行求解 K_m 和 V_max 值。

Lineweaver-Burk plot

固定抑制剂浓度，以 $\frac{1}{v}$ 对 $\frac{1}{[S]}$ 作图，连接得到一条直线，称为 Lineweaver-Burk plot；有几个抑制剂浓度，就可以得到几条直线。

Figure 3. Lineweaver-Burk plot

抑制类型	图形特征
竞争性抑制	所有直线相交于 y 轴上同一点
反竞争性抑制	所有直线互相平行
混合型抑制	所有直线相交于 x 轴负半轴和 y 轴构成的第二象限内
非竞争性抑制	所有直线相交于 x 轴的负半轴上某一点

Dixon plot

固定底物浓度，以初始速率的倒数 $\frac{1}{v}$ 对抑制剂浓度 [I] 作图，连接得到一条直线，称为 Dixon plot。有几个固定底物浓度，就可以得到几条直线。

抑制类型	图形特征	K_i
竞争性抑制	所有直线相交于第二象限	交点的横坐标的相反数
非竞争性抑制	所有直线相交于 x 轴的负半轴上	交点的横坐标的相反数
反竞争性抑制	所有直线平行	/
混合型抑制	所有直线相交于第二象限	交点的横坐标的相反数

Secondary plot

以 Lineweaver-Burk 图中得到的斜率（Sloop）对抑制剂浓度 [I] 作图，连接得到一条直线，称为二级重绘图（Secondary plot）。

x 轴截距即为 − K_i。
y 轴截距是在没有抑制剂（[I] = 0）时，Lineweaver-Burk 图的斜率，即 $\frac{K_m}{V_{max}}$。

Figure 4. 抑制常数测量示例：(A) Lineweaver-Burk plot, (B) Secondary plot, and (C) Dixon plot

附：Cheng-Prusoff 方程

Cheng-Prusoff 方程可以将 IC₅₀ 值转换成绝对抑制常数 K_i，使不同底物浓度下测量的 IC₅₀ 具有可比性。

抑制类型	IC₅₀ 与 K_i 的关系	IC₅₀ 如何随 [S] 变化
竞争性抑制	$K_i = \frac{IC_{50}}{1 + \frac{[S]}{K_{m}}}$	增大
非竞争性抑制	K_i = IC₅₀	不变
反竞争性抑制	$K_i = \frac{IC_{50}}{1 + \frac{K_{m}}{[S]}}$	减小
混合型抑制	$IC_{50}=\frac{K_m+[S]}{\frac{K_m}{K_i}+\frac{[S]}{K_i^{\prime}}}$	增大或减小

注：对混合型抑制，设 K_i^′ = α ⋅ K_i，有 $IC_{50}=\frac{K_m+[S]}{\frac{K_m}{K_i}+\frac{[S]}{\alpha K_i}}=K_i\cdot\frac{\alpha(K_m+[S])}{\alpha K_m+[S]}$。

Cheng-Prusoff 方程也可用于计算 K_i。在已知动力学参数（K_m）及抑制剂抑制类型下，可以用 IC₅₀ 及对应的 [S] 计算 K_i。

半数抑制浓度

半数抑制浓度（IC₅₀）指抑制 50% 给定生物过程或生物成分时抑制剂的浓度。

对抑制率 % 有：

$$ \% \text{ Inhibition} = \frac{[I]^{h}}{[I]^{h} + IC_{50}^{h}} \times 100\% $$

或

$$ \% \text{ Inhibition} = \frac{1}{1 + \left(\frac{IC_{50}}{[I]}\right)^{h}} \times 100\% $$

以抑制剂浓度 [I] 的对数对 % Inhibition 作图，曲线呈 S 形。IC₅₀ 指 % Inhibition = 50% 时的 [I]。

Figure 5. 浓度和抑制率 % 曲线

IC₅₀ 的测量

以酶活实验为例，在固定的酶浓度和底物浓度（通常在 K_m 值附近，此时反应最敏感）下，通过测量一系列不同抑制剂浓度 [I] 及对应的 % Inhibition，然后进行拟合求解。

References

高国全, 汤其群. 生物化学与分子生物学 [M]. 第10 版. 北京：人民卫生出版社, 2024.
Google Gemini with 2.5 Pro
By Athel cb - Own work, CC BY-SA 4.0, https://commons.wikimedia.org/w/index.php?curid=130486959 (Figure 3)
Identification, crystallization, and first X-ray structure analyses of phenyl boronic acid-based inhibitors of human carbonic anhydrase-II: https://doi.org/10.1016/j.ijbiomac.2024.131268 (Figure 4)

酶动力学基本参数

米氏方程

酶动力学参数的测定

Lineweaver-Burk plot

抑制常数

竞争性抑制

非竞争性抑制

反竞争性抑制

混合型抑制

抑制常数的测量

基本思路

结果分析

酶动力学参数

Lineweaver-Burk plot

Dixon plot

Secondary plot

附：Cheng-Prusoff 方程

半数抑制浓度

IC50 的测量

References

IC₅₀ 的测量