LC-MS/MS 液质方法开发

发表于 更新于 Waline：

前言

在前文中我们提到：

多重反应监测（Multiple Reaction Monitoring, MRM），Q1 选择固定母离子，Q2 CID 碎裂，Q3 选择固定子离子（即离子对）；用于高选择性、高灵敏度定量分析，是金标准定量方法。

然而在实际研发工作中，部分研究者容易将液质方法开发局限地理解为“质谱参数的优化”（如 DP、CE 等参数），而忽视了液相色谱参数优化的重要性。

LC-MS/MS 分析方法开发，本质上是以质谱 MRM 模式作为高特异性检测手段的液相色谱分析方法开发。以下三个研发中的典型场景，足以说明液相参数对分析结果的关键作用：

  1. 基质效应的可控性：不同生物基质（如血浆、尿液、组织匀浆）中的内源性干扰物（如磷脂）浓度与成分大不相同。若目标分析物与基质干扰物未能实现色谱分离，共洗脱（co-elution）将严重抑制或增强 ESI 源内的电离效率。
  2. 电离响应的调控：通过微调流动相的 pH，能够直接控制酸碱型目标分子的电离状态。pH 每改变 1 个单位，溶液中离子的浓度将发生 10 倍的变化。在流动相中寻找合适的 pH 缓冲体系，远比单纯在质谱端调节源参数来增强响应要高效、稳定得多。
  3. 手性与同分异构体的拆分：液质方法的高特异性是由分析物的保留时间（Retention Time, \(t_{\text{R}}\)）与质谱监测离子对共同决定的。由于同分异构体（如某些代谢产物、位置异构体）具有相同的母/子离子对，质谱端无法对其进行区分，必须依赖色谱柱固定相与流动相的协同作用实现空间分离。

不同于过往的内容，本文内容主要基于个人对液质方法开发的理解，部分内容缺乏直接的文献支撑，难免有不到之处，欢迎各位批评讨论。

Workflows

下面是液质方法开发的流程图，后续内容将根据流程图内容展开。

graph TD

  

    %% ================= 全局样式定义 =================

    classDef default fill:#fff,stroke:#333,stroke-width:1px,rx:4,ry:4;

    classDef decision fill:#fff,stroke:#bf5b5b,stroke-width:1.5px;

    classDef optional fill:#fff,stroke:#333,stroke-width:1px,stroke-dasharray: 5 5;

    classDef milestone fill:#e8f8f5,stroke:#1abc9c,stroke-width:1.5px,rx:4,ry:4;

  

    %% ================= Step 0: 分析前评估 =================

    subgraph Step0 ["Step 0: 分析前评估"]

        direction TB

        N01["生物样品分析需求评估：
目标 LLOQ、线性范围、基质类型"]

        N02["理化性质评估：
Log P、pKa、溶解度、稳定性"]

        N03["样本前处理初筛：
样品稀释、PPT、LLE、SPE 等"]

        N04["色谱模式初筛：
RP、HILIC 等"]

        N05["内标策略：
优先推荐 SIL-IS"]

        N06["其他考量：
如容器非特异性吸附、溶剂化析出、避光防氧化"]

        N07{"确定初始分析方案"}

  

        N01 --> N02

        N02 --> N03

        N02 --> N04

        N02 --> N05

        N02 --> N06

        N03 --> N07

        N04 --> N07

        N05 --> N07

        N06 --> N07

    end

  

    N07 --->|"使用目标物及内标标准品"| N11

  

    %% ================= Step 1: 化合物有关参数优化 =================

    subgraph Step1 ["Step 1: 化合物有关参数优化"]

        N11["Q1 Full Scan
确认母离子"]

        N12["优化 DP 与 EP
提高母离子传输效率"]

        N13["Q3 Product Ion Scan
筛选特征碎片离子"]

        N14["建立 MRM 定量与定性离子对
独立优化 CE 与 CXP"]

        N15["通道特异性排查：
考察交叉串扰与源内裂解"]

        N16{"结果是否符合要求"}

  

        N11 --> N12

        N12 --> N13

        N13 --> N14

        N14 --> N15

        N15 --> N16

        N16 -->|"否，存在交叉串扰：增加 Pause time 或更换碎片"| N14

        N16 -->|"否，源内裂解明显：降低 DP 软化电离"| N12

    end

  

    N16 -->|"是，符合要求"| N17["化合物特异性参数设定"]

    N21["引入色谱流速与初始流动相"]

  

    %% ================= Step 2: 离子源有关参数优化 =================

    subgraph Step2 ["Step 2: 离子源有关参数优化"]

        N22{"在线三通进样"}

        N23["优化离子源参数：
Gas 1、Gas 2、TEM、IS、CUR、电晕针位置"]

  

        N17 --> N22

        N21 --> N22

        N22 --> N23

    end

  

    N23 -->|"输出：锁定完整质谱参数"| N24["完整质谱参数"]

  

    %% ================= Step 3: 色谱条件优化 =================

    subgraph Step3 ["Step 3: 色谱条件优化"]

        N31["优化色谱参数：
色谱柱、流速、梯度、pH、柱温、洗针液"]

        N32{"色谱条件是否大幅调整"}

        N33{"系统适用性评估：
峰形、保留时间、灵敏度 LLOQ、残留"}

        N34{"选择性排查：
潜在代谢物干扰是否色谱分离"}

        N35{"初步考察：
基质效应与提取回收率是否符合预期"}

  

        N24 --> N31

        N31 --> N32

        N32 -->|"是：重新优化离子源参数"| N22

        N32 -->|"否：进行系统适用性评估"| N33

        N33 -->|"否：微调色谱参数"| N31

        N33 -.-> N34

        N34 -.->|"否：调整色谱柱或洗脱梯度"| N31

        N33 -->|"是：系统适用性良好"| N35

        N34 -.->|"是：空间分离通过"| N35

    end

  

    %% ================= Step 4: 基质效应评估与优化 =================

    subgraph Step4 ["Step 4: 基质效应评估与优化"]

        N41["柱后输注法
明确基质效应时间分布区"]

        N42{"基质效应是否符合验收标准"}

        N43["由 PPT 变更为 LLE 或 SPE"]

        N44["引入稳定同位素内标进行基质补偿"]

  

        N35 -->|"否，显著离子抑制/增强：采用柱后输注法"| N41

        N35 -->|"否，回收率偏低/非线性：重新评估初始方案"| N07

        N41 --> N42

        N42 -->|"否，出峰与干扰区重合：调整色谱参数"| N31

        N42 -->|"否，基质干扰过强"| N43

        N42 -->|"否，内标补偿不佳"| N44

        N43 -.->|"重置分析方案"| N07

        N44 -.->|"重置分析方案"| N07

    end

  

    N35 -->|"是：进入采集统筹"| N51

    N42 -->|"是：进入采集统筹"| N51

  

    %% ================= Step 5: 多通道采集方法建立 =================

    subgraph Step5 ["Step 5: 多通道采集方法建立"]

        N51["设定基础 MRM 参数：
配置 Dwell time、Pause time"]

        N52{"常规 MRM 采集质量评估：
单峰采点数是否不少于 15 个"}

        N53["配置 Scheduled MRM：
根据峰宽分配 Window width 缩短周期"]

        N54{"sMRM 模式下采点数是否不少于 15 个"}

        N55["多通道交叉干扰综合评估：
验证高浓度样本通道间互扰与内标纯度"]

        N56["输出最终 LC-MS/MS 采集方法"]

  

        N51 --> N52

        N52 -->|"否，周期过长：引入 sMRM"| N53

        N53 --> N54

        N54 -->|"否，保留时间拥挤：调整色谱错开洗脱"| N31

        N52 -->|"是，常规采点合规"| N55

        N54 -->|"是，sMRM 统筹成功"| N55

        N55 -->|"排查通过：锁定采集方案"| N56

    end

  

    %% ================= Step 6: 方法学验证 =================

    N56 --> N61

  

    subgraph Step6 ["Step 6: 基于 ICH M10 的方法验证"]

        N61{"方法预验证评估：
真实基质考察 LLOQ、线性、精密度"}

        N62["全套验证实施：
选择性、线性、最低定量限、准确度、精密度、
回收率、基质效应、稳定性、残留、ISR"]

  

        N61 -->|"是，预验证达标：锁定方法"| N62

        N61 -->|"否，预验证未达标：重新优化"| N07

    end

  

    %% ================= 样式挂载 =================

    class N07,N16,N22,N32,N33,N35,N42,N52,N54,N61 decision;

    class N34 optional;

    class N24,N56,N62 milestone;

  

    style Step0 fill:#fcfcfc,stroke:#b2babb,stroke-width:1.5px,stroke-dasharray: 4 4,rx:10,ry:10;

    style Step1 fill:#fcfcfc,stroke:#b2babb,stroke-width:1.5px,stroke-dasharray: 4 4,rx:10,ry:10;

    style Step2 fill:#fcfcfc,stroke:#b2babb,stroke-width:1.5px,stroke-dasharray: 4 4,rx:10,ry:10;

    style Step3 fill:#fcfcfc,stroke:#b2babb,stroke-width:1.5px,stroke-dasharray: 4 4,rx:10,ry:10;

    style Step4 fill:#fcfcfc,stroke:#b2babb,stroke-width:1.5px,stroke-dasharray: 4 4,rx:10,ry:10;

    style Step5 fill:#fcfcfc,stroke:#b2babb,stroke-width:1.5px,stroke-dasharray: 4 4,rx:10,ry:10;

    style Step6 fill:#fcfcfc,stroke:#b2babb,stroke-width:1.5px,stroke-dasharray: 4 4,rx:10,ry:10;

Step 0: 分析前评估

graph TD
    %% 样式挂载
    classDef default fill:#fff,stroke:#333,stroke-width:1px,rx:4,ry:4;
    classDef decision fill:#fff,stroke:#bf5b5b,stroke-width:1.5px;
    classDef milestone fill:#e8f8f5,stroke:#1abc9c,stroke-width:1.5px,rx:4,ry:4;

    subgraph Step0 ["Step 0: 分析前评估"]
        direction TB
        Start(["开始"]) --> N01["生物样品分析需求评估：
目标 LLOQ、线性范围、基质类型"]
        N01 --> N02["理化性质评估：
Log P、pKa、溶解度、稳定性"]
        N02 --> N03["样本前处理初筛：
样品稀释、PPT、LLE、SPE 等"]
        N02 --> N04["色谱模式初筛：
RP、HILIC 等"]
        N02 --> N05["内标策略：
优先推荐 SIL-IS"]
        N02 --> N06["其他考量：
如容器非特异性吸附、溶剂化析出、避光防氧化"]
        N03 --> N07{"确定初始分析方案"}
        N04 --> N07
        N05 --> N07
        N06 --> N07
    end

    N07 --->|"使用目标物及内标标准品"| NextStep(["进入 Step 1: 化合物参数优化"])

    class N07 decision;
    class NextStep milestone;
    style Step0 fill:#fcfcfc,stroke:#b2babb,stroke-width:1.5px,stroke-dasharray: 4 4,rx:10,ry:10;

明确分析需求，是整个分析方法开发的起点。最低定量下限（LLOQ）、线性范围以及基质类型，这些客观条件直接决定了检测器的选择（灵敏度是否匹配）以及样品前处理的策略。

蛋白沉淀（Protein Precipitation, PPT）是生物体液样品分析中最常用的前处理技术之一。通过加入高比例有机相（如甲醇、乙腈）来降低溶剂的介电常数，从而破坏蛋白质表面的水化层，促使高分子蛋白发生变性与沉淀。如果选择 PPT，就需要考虑蛋白质的沉淀完全度、目标化合物的回收率（Recovery）以及内源性磷脂潜在的基质效应等。

在初筛时，我们需要重点考察蛋白质的沉淀完全度、目标化合物的回收率（Recovery）以及潜在的基质效应（内源性磷脂的残留）。

评估分析物的理化性质是确立色谱条件的基础：

  • 电离行为与缓冲体系：分析物能否电离？\(\text{p}K_{\text{a}}\) 是多少？其 \(\log D\) 曲线随 pH 的分布趋势如何？这些数据直接决定了水相中缓冲盐体系的选择。

  • 保留行为与色谱模式：在目标 pH 条件下，分析物是以离子形式还是分子形式存在？应该选择反相色谱（RP-LC）还是亲水相互作用色谱（HILIC）？

  • 内标（IS）策略：同位素标记内标（Stable Isotope-Labeled IS, SIL-IS）是否易于获取？还是在开发初期先引入结构类似物作为通用内标？

此外，一些特殊考虑也应该尽早识别。例如，化合物是否存在容器的非特异性吸附（NSA）？是否易发生光降解或溶液水解？对于强脂溶性化合物，还需注意初始流动相中的比例，以防其在毛细管内发生溶剂化析出。

通过文献调研与先验知识，我们在开发前对优化方向应当有清晰的定性认知，优化方向应该预先判断，参数数值需要试验摸索。

Step 1: 化合物有关参数优化

graph TD
    %% 样式挂载
    classDef default fill:#fff,stroke:#333,stroke-width:1px,rx:4,ry:4;
    classDef decision fill:#fff,stroke:#bf5b5b,stroke-width:1.5px;
    classDef milestone fill:#e8f8f5,stroke:#1abc9c,stroke-width:1.5px,rx:4,ry:4;

    subgraph Step1 ["Step 1: 化合物有关参数优化"]
        PrevStep(["来自 Step 0"]) --> N11["Q1 Full Scan
确认母离子"]
        N11 --> N12["优化 DP 与 EP
提高母离子传输效率"]
        N12 --> N13["Q3 Product Ion Scan
筛选特征碎片离子"]
        N13 --> N14["建立 MRM 定量与定性离子对
独立优化 CE 与 CXP"]
        N14 --> N15["通道特异性排查：
考察交叉串扰与源内裂解"]
        N15 --> N16{"结果是否符合要求"}
        N16 -->|"否，存在交叉串扰：增加 Pause time 或更换碎片"| N14
        N16 -->|"否，源内裂解明显：降低 DP 软化电离"| N12
    end

    N16 -->|"是，符合要求"| N17["化合物特异性参数设定"]
    N17 --> NextStep(["进入 Step 2: 离子源参数优化"])

    class N16 decision;
    class N17,NextStep milestone;
    style Step1 fill:#fcfcfc,stroke:#b2babb,stroke-width:1.5px,stroke-dasharray: 4 4,rx:10,ry:10;

这一步的目的是确认化合物的特征离子对，并优化去簇电压（Declustering Potential, DP）、入口电压（Entrance Potential, EP）、碰撞能量（Collision Energy, CE）以及碰撞室出口电压 （Collision Cell Exit Potential, CXP）。需要注意的是，EP、CE 和 CXP 主要取决于目标化合物的固有分子结构及所选子离子的理化性质，但 DP 除此以外，还容易受到流动相流速和组成的影响。因此，在 Step 3 色谱条件优化中，若流动相流速和组成发生剧烈变动，可能需要重新优化 DP 参数。

本阶段通常采用针泵直接进样（Infusion）模式。将目标化合物的标准品（10 ng/mL–1 μg/mL）1溶解于合适的溶液中（初始推荐采用有机相 : 缓冲液 = \(1:1\) 的混合溶液，并含有微量甲酸或醋酸铵以促进电离）。通过注射泵以 5–10 μL/min 的流速将其直接注入质谱仪2。

质谱响应信号强度（Intensity）通常应处于以下范围1：

  • 一级质谱扫描（Q1 Scan 模式）：特征母离子信号强度维持在 \(10^4–10^6 \text{ cps}\)。

  • 二级质谱扫描（Product Ion Scan 模式）：碎片子离子信号强度维持在 \(10^3–10^5 \text{ cps}\)。

确认离子对后，为每对离子对独立优化 DP、EP、CE 和 CXP 参数，选择质谱响应最高且相对平缓的数值作为工作参数。

当然，该步骤也可以直接在三通进样（T-infusion）模式下进行，具体可借鉴 Step 2。

完成每对 MRM 通道的 DP、EP、CE 和 CXP 参数优化后，需要考虑交叉串扰（Cross-talk）和源内裂解（In-source CID）对检测信号的干扰3。

交叉串扰（Cross-talk） 指在前一 MRM 通道分析时，碰撞池没有被充分清除，残留的子离子与下一个 MRM 通道的子离子质量相同，使下一个 MRM 通道信号的检测偏高的现象。特别是对于 SIL-IS 和分析物，二者往往共洗脱，且容易出现相同的产物离子。

交叉串扰排查方法使用针泵直接进样（Infusion）模式，在各自 MRM 通道（如分析物）下，观察高浓度的其他化合物标准品溶液（如 SIL-IS）是否有信号。

源内裂解（In-source CID） 指某些不稳定的化合物，还未进入碰撞池前，在离子源中就部分裂解或转化成目标分析物的现象，比如一些葡萄糖醛酸结合物代谢物。

源内裂解排查方法同样也使用针泵直接进样（Infusion）模式，注入可能的源内裂解标准品溶液，观察分析物 MRM 通道下的响应。

源内裂解可以通过色谱分离和（或）降低离子源参数（DP、TEM、IS 等）解决。

关于交叉串扰和源内裂解可以进一步阅读 Cross-Signal Contribution as a Challenge in LC-MS/MS Bioanalysis3 一文。

Step 2: 离子源有关参数优化

graph TD
    %% 样式挂载
    classDef default fill:#fff,stroke:#333,stroke-width:1px,rx:4,ry:4;
    classDef decision fill:#fff,stroke:#bf5b5b,stroke-width:1.5px;
    classDef milestone fill:#e8f8f5,stroke:#1abc9c,stroke-width:1.5px,rx:4,ry:4;

    subgraph Step2 ["Step 2: 离子源有关参数优化"]
        N17(["来自 Step 1: 化合物参数设定"]) --> N22{"在线三通进样"}
        N21["引入色谱流速与初始流动相"] --> N22
        N22 --> N23["优化离子源参数：
Gas 1、Gas 2、TEM、IS、CUR、喷雾针位置"]
    end

    N23 -->|"输出：锁定完整质谱参数"| N24["完整质谱参数"]
    N24 --> NextStep(["进入 Step 3: 色谱条件优化"])

    class N22 decision;
    class N24,NextStep milestone;
    style Step2 fill:#fcfcfc,stroke:#b2babb,stroke-width:1.5px,stroke-dasharray: 4 4,rx:10,ry:10;

这一步，在 Step 1 确定的化合物存在且优化参数基础上，开始引入流动相体系，进一步优化质谱信号。

在三通进样（T-infusion）下，使用三通接头将来自注射泵的标准品溶液和 FIA 模式的流动相混合后，最终引入质谱仪。注射泵流路与 Step 1 中的针泵模式一致；FIA 模式是将 LC 的色谱柱更换成二通，泵入初始流速和流动相。引入色谱流速与初始流动相应该与最终的方法一致，在 Step 3 色谱条件优化中，若调整流动相流速和流动相组成，可能重新优化离子源参数。

在该模式下，能够同时提供稳定的样品信号和流动相流速和组分，因此可以优化与离子源有关的参数。除了 Gas 1、Gas 2、TEM、IS、CUR 外，还可能需要调整喷雾针位置（喷雾针离采样小孔越近，信号越好，但噪声也会增大），以获得最佳信号。

SCIEX 5500 系列通常配置 Turbo V Source 离子源，但 6500 系列可能配备 IonDrive Turbo V Source，二者略有不同。下面给出 Turbo V Ion Source 和 IonDrive Turbo V Ion Source 离子源的初始参数，离子源参数优化可在此基础上进行。

Turbo V Ion Source4

Table 1. Parameter Optimization for the TurbolonSpray Probe

Parameters Typical Values (Low) Typical Values (Medium) Typical Values (High) Operational Range
LC flow rate 5 µL/min to 50 µL/min 200 µL/min 1 000 µL/min 5 µL/min to 3 000 µL/min
Ion source gas 1 (nebulizer gas) 20 psi to 40 psi 40 psi to 60 psi 40 psi to 60 psi 0 psi to 90 psi
Ion source gas 2 (heater gas) 0 psi 50 psi 50 psi 0 psi to 90 psi
Spray voltage 5500 V 5500 V 5500 V 5500 V
Gas for the Curtain Gas interface 20 psi 35 psi 50 psi 20 psi to 50 psi
Ion source temperature1 Ambient to 200 °C 200 °C to 650 °C 400 °C to 750 °C Up to 750 °C
Declustering potential (DP)2 Positive: 70 V
Negative: –70 V		 Positive: 70 V
Negative: –70 V		 Positive: 100 V
Negative: –100 V		 Positive: 0 V to 400 V
Negative: –400 V to 0 V
Probe vertical micrometer setting 7 to 10 2 to 5 0 to 2 0 to 13
Probe horizontal micrometer setting 4 to 6 4 to 6 4 to 6 0 to 10

Table 2. Parameter Optimization for the APCI Probe

Parameter Typical Value Operational Range
LC flow rate 1 000 µL/min 200 µL/min to 3 000 µL/min
Ion source gas 1 (nebulizer gas) 30 psi 0 psi to 90 psi
Gas for the Curtain Gas interface 20 psi 20 psi to 50 psi
Ion source temperature³ 400 °C 100 °C to 750 °C
Nebulizer current Positive: 3 µA
Negative: –3 µA		 Positive: 0 µA to 5 µA
Negative: –5 µA to 0 µA
Declustering potential (DP) Positive: 60 V
Negative: –60 V		 Positive: 0 V to 300 V
Negative: –300 V to 0 V
Probe vertical micrometer setting 4 Scale 0 to 13
  • 1 Optimum temperature values depend on the compound and mobile phase composition. Higher aqueous content requires a higher temperature. Zero (0) means no temperature is applied.
  • 2 DP values depend on the compound.
  • 3 Temperature values depend on the compound.

IonDrive Turbo V Ion Source5

Table 3. Parameter Optimization for the TurbolonSpray Probe

Parameters Typical Values (Low) Typical Values (Medium) Typical Values (High) Operational Range
LC flow rate 5 µL/min to 50 µL/min 200 µL/min 1 000 µL/min 5 µL/min to 3 000 µL/min
Ion source gas 1 (nebulizer gas) 20 psi to 40 psi 40 psi to 60 psi 40 psi to 60 psi 0 psi to 90 psi
Ion source gas 2 (heater gas) 0 psi 50 psi 50 psi 0 psi to 90 psi
IonSpray Voltage, IonSpray Voltage Floating, or Spray voltage 5500 V 5500 V 5500 V 5500 V
Gas for the Curtain Gas interface 30 psi 30 psi 30 psi 20 psi to 50 psi
Ion source temperature1 Ambient to 200 °C 200 °C to 650 °C 400 °C to 750 °C Up to 750 °C
Declustering potential (DP)2 Positive: 70 V
Negative: - 70 V		 Positive: 70 V
Negative: - 70 V		 Positive: 100 V
Negative: - 100 V		 Positive: 0 V to 400 V
Negative: - 400 V to 0 V
Probe horizontal micrometer setting 3 to 8 3 to 8 3 to 8 0 to 10

Table 4. Parameter Optimization for the APCI Probe

Parameter Typical Value Operational Range
LC flow rate 1 000 µL/min 200 µL/min to 3 000 µL/min
Ion source gas 1 (nebulizer gas) 30 psi 0 psi to 90 psi
Gas for the Curtain Gas interface 30 psi 20 psi to 50 psi
Ion source temperature3 400 °C 100 °C to 750 °C
Nebulizer current Positive: 3 µA
Negative: –3 µA		 Positive: 0 µA to 5 µA
Negative: –5 µA to 0 µA
Declustering potential (DP) Positive: 60 V
Negative: –60 V		 Positive: 0 V to 300 V
Negative: –300 V to 0 V
Probe vertical micrometer setting 5 Scale 0 to 13
  • 1 Optimum temperature values depend on the compound and mobile phase composition. Higher aqueous content requires a higher temperature. Zero (0) means no temperature is applied.
  • 2 DP values depend on the compound.
  • 3 Temperature values depend on the compound.

参数描述4,5

Table 5. 由离子源决定的参数

参数 描述
Ion source gas 1 控制 TurbolonSpray 和 APCI 探针的雾化气。请参阅以下章节：工作原理 — 离子源。
Ion source gas 2 控制用于 TurbolonSpray 探针的加热器气体。当温度和加热气流速的组合使得 LC 溶剂到达了几乎完全汽化的临界点时，便可获得最佳灵敏度。在背景噪声显著增加的情况下，若要优化离子源气体 2，可提高流量，以达到最佳信号或信噪比。气体流量过高会产生噪声或不稳定信号。请参阅以下章节：工作原理 — 离子源。
Curtain gas 控制 Curtain Gas 接口的气体流速。Curtain Gas 接口位于气帘板和小孔之间。它可以防止周围空气和溶剂液滴进入并污染电离光学器件，同时还可以通过在真空接口和喷射头之间产生的电场引导样本离子进入真空室。离子入口光学器件污染会降低 Q0 传输、稳定性和灵敏度，并增加背景噪声。在不损失灵敏度的情况下，保持 Curtain Gas 接口的气体流速尽可能高。
离子源温度（TEM） 控制用于样本汽化的热量。理想离子源温度是能够使样本彻底汽化的最低温度。以 50 °C 的增量进行优化。
离子源温度 (TurbolonSpray 探针) 控制 TurbolonSpray 探针的加热器气体。当温度和离子源气体 2 流速的组合使得 LC 溶剂到达了几乎完全汽化的临界点时，便可获得最佳灵敏度。随着溶剂中有机物含量的增加，最佳探针温度会逐渐降低。当溶剂为 100% 甲醇或乙腈时，探针性能优化可低至 300 °C。100% 的水溶剂（流速约为 1,000 μL/min）要求探针的最高温度达到 750 °C。如果离子源温度设定值过低，则汽化不完全，可见液滴会喷入离子源罩壳。如果离子源温度设置过高，溶剂会在探针尖端过早汽化，尤其是在探针垂直千分尺设置得过于靠近采样小孔时（5 至 13）。
离子源温度 (APCI 探针) 控制 APCI 探针的温度。溶剂中有机物的含量越高，探针的理想温度应当越低。当溶剂为 100% 甲醇或乙腈、流速为 1,000 μL/min 时，探针性能优化可低至 400 °C。流速被设为 2,000 μL/min 的 100% 的水溶剂要求探针的最低温度不低于 700 °C。如果离子源温度设定值过低，则汽化不完全，可见液滴会喷入离子源罩壳。如果离子源温度设定值过高，则会发生样本热降解。
雾化电流（Nebulizer current） 控制经过 APCI 探针的电荷放电针的电流。放电会电离溶剂分子，继而会使样本分子电离。对于 APCI 探针，电荷放电针上的电流通常在很宽的变化范围内进行优化（正极性时约为 1 μA 至 5 μA）。如需优化，请从数值为 1 开始，然后逐渐增加，直至达到最佳信号或信噪比。如果增加电流时发现信号无变化，则将电流保持在最低设定值，以达到最佳灵敏度（例如 2 μA）。
离子源电压（Ion source voltage） 控制施加到 TurbolonSpray 探针喷射器上的电压（在离子源中使样本电离）。参数值取决于极性，会影响喷雾的稳定性和灵敏度。在 Analyst 软件中，这是 IonSpray Voltage 字段，在 Analyst TF 中，是 IonSpray Voltage Floating 字段，而在 SCIEX OS 中，是 Spray voltage 字段。
接口加热器（Interface heater） 对于 SCIEX 3500、4500、5500、5500+、6500、6500+ 和 TripleTOF 系统，该参数始终开启。开启和关闭接口加热器。加热接口有助于最大限度地增强离子信号，防止离子光学系统的污染。除非用户分析的化合物特别不稳定，否则建议用户对接口进行加热。

Step 3: 色谱条件优化

graph TD
    %% 样式挂载
    classDef default fill:#fff,stroke:#333,stroke-width:1px,rx:4,ry:4;
    classDef decision fill:#fff,stroke:#bf5b5b,stroke-width:1.5px;
    classDef optional fill:#fff,stroke:#333,stroke-width:1px,stroke-dasharray: 5 5;
    classDef milestone fill:#e8f8f5,stroke:#1abc9c,stroke-width:1.5px,rx:4,ry:4;

    subgraph Step3 ["Step 3: 色谱条件优化"]
        N24(["来自 Step 2: 完整质谱参数"]) --> N31["优化色谱参数：
色谱柱、流速、梯度、pH、柱温、洗针液"]
        N31 --> N32{"色谱条件是否大幅调整"}
        N32 -->|"是：重新优化离子源参数"| BackToStep2(["返回 Step 2"])
        N32 -->|"否：进行系统适用性评估"| N33{"系统适用性评估：
峰形、保留时间、灵敏度 LLOQ、残留"}
        N33 -->|"否：微调色谱参数"| N31
        N33 -.-> N34{"选择性排查：
潜在代谢物干扰是否色谱分离"}
        N34 -.->|"否：调整色谱柱或洗脱梯度"| N31
        N33 -->|"是：系统适用性良好"| N35{"初步考察：
基质效应与提取回收率是否符合预期"}
        N34 -.->|"是：空间分离通过"| N35
    end

    N35 -->|"否，显著离子抑制/增强：采用柱后输注法"| NextStep(["进入 Step 4: 基质效应评估"])
    N35 -->|"否，回收率偏低/非线性：重新评估初始方案"| Reset(["返回 Step 0 重新评估"])
    N35 -->|"是：进入采集统筹"| EndStep(["进入 Step 5: 采集统筹"])

    class N32,N33,N34,N35 decision;
    class NextStep,EndStep,Reset milestone;
    style Step3 fill:#fcfcfc,stroke:#b2babb,stroke-width:1.5px,stroke-dasharray: 4 4,rx:10,ry:10;

在获得完整质谱参数后，就可以开始优化色谱条件，相关内容在《高效液相色谱方法的建立-01：分析方法开发》一文已经详细阐述。

由于 LC-MS/MS 常搭配 UHPLC，使用的色谱柱填料颗粒更小，内径更小，柱长更短，因此《高效液相色谱方法的建立-01：分析方法开发》中 Table 3. 初始条件参数 需要根据 Table 4. Column volumes for various column configurations and recommended scouting gradient times 中内容换算。

下面给出一个 LC-UV 和 LC-MS/MS 梯度程序的初始色谱条件参考：

Table 6. Comparison of Conventional LC-UV and LC-MS Scouting Gradient Conditions6

Variable LC-UV LC-MS Comment for MS
Column Type C8 or C18 (type B) C18 (type B) Stronger retention preferred
Dimensions 150 × 4.6 mm 50 × 2.1 mm
Particle size 5 µm 3 µm
Resolution ≥ 1.7–2.0 ≥ 1.0 < 1.0 often OK with isotopic standards
Dwell volume 1.0–4.0 mL 0.1–1.0 mL Smaller is better
Mobile phase Organic ACN ACN or MeOH UV absorbance not important
Buffer Phosphate, acetate Formate, acetate, ammonia Must be volatile
Ion pairing (bases) Sulfonates TFA or HFBA Must be volatile
Flow rate 1.5–2.0 mL/min 0.2–0.5 mL/min Smaller flow rate desired
Temperature 30–35 °C 30–35 °C
Gradient 5–100% B in 15 min 5–100% B in 4 min (0.5 mL/min) or 10 min (0.2 mL/min) \(k^* \approx 5\)
Sample Volume ≤ 50 µL ≤ 10 µL Injection solvent percent B ≤ mobile phase percent B
Weight ≤ 10 µg ≤ 1 µg Proportional to column volume
\(k^*\) ~ 5 ~ 5
Standardization Internal or external Usually internal Stable–label internal standard preferred

与 LC-UV 方法开发中的分离度要求不同，LC-MS/MS 的选择性由保留时间和离子对共同构成，即使色谱的分离度不足，仍可能通过特征离子对补偿。因此，当要求更短的分析时间时，可以尝试缩短梯度时间，而不要求 \(k^* \approx 5\)。

事实上，LC-MS/MS 色谱分离的核心在于实现分析物与内源性基质（及潜在杂质）的有效分离，确保分析物在相对纯净的流动相背景下洗脱，从而最大限度地降低基质效应。

另外，分析物注入质谱时的流动相组成可能影响离子源参数甚至 DP 参数。由于在 Step 2 的离子源参数优化中默认采用了 50% B 的流动相，若实际梯度洗脱中流动相组成发生了剧烈变化，则需重新评估，并考虑返回优化离子源参数（甚至包括 DP）。

计算梯度洗脱中分析物流出时，进入到质谱的流动相具体浓度：

\[ \%B \approx \phi_{0} + \frac{t_{R} - t_0 - t_{D}}{t_G} \cdot \Delta\phi \]

  • \(\phi_{0}\)：梯度洗脱的初始浓度；
  • \(t_{R}\)：分析物的保留时间；
  • \(t_0\)：死时间；
  • \(t_D\)：驻留时间；
  • \(t_G\)：梯度时间；
  • \(\Delta\phi\)：%B 梯度变化范围，如乙腈从 5% 线性升到 95%，\(\Delta\phi = 90\%\)。

初步考察：基质效应与提取回收率

通常分别配制以下三份溶液7进样，并获取分析物的响应值或内标归一化后的响应：

  • Solution A（Neat standard）：纯溶剂标准溶液
  • Solution B（Post-extraction spiked matrix）：提取后添加目标物的空白基质
  • Solution C（Pre-extraction spiked matrix）：提取前添加目标物的空白基质（模拟真实待测样品）

并计算以下参数：

\[ \begin{aligned} \text{ME} (\%) &= \frac{B}{A} \times 100 \\ \text{RE} (\%) &= \frac{C}{B} \times 100 \\ \text{PE} (\%) &= \frac{C}{A} \times 100 = \frac{\text{ME} \times \text{RE}}{100} \end{aligned} \]

  • \(\text{ME}\)：基质效应（Matrix effect）；
  • \(\text{RE}\)：提取回收率（Extraction recovery）；
  • \(\text{PE}\)：过程效率（Process efficiency）。

Step 4: 基质效应评估与优化

graph TD
    %% 样式挂载
    classDef default fill:#fff,stroke:#333,stroke-width:1px,rx:4,ry:4;
    classDef decision fill:#fff,stroke:#bf5b5b,stroke-width:1.5px;
    classDef milestone fill:#e8f8f5,stroke:#1abc9c,stroke-width:1.5px,rx:4,ry:4;

    subgraph Step4 ["Step 4: 基质效应评估与优化"]
        FromStep3(["来自 Step 3: MF/RE 初筛异常"]) --> N41["柱后输注法
明确基质效应时间分布区"]
        N41 --> N42{"基质效应是否符合验收标准"}
        N42 -->|"否，出峰与干扰区重合：调整色谱参数"| BackToStep3(["返回 Step 3 调整色谱"])
        N42 -->|"否，基质干扰过强"| N43["由 PPT 变更为 LLE 或 SPE"]
        N42 -->|"否，内标补偿不佳"| N44["引入稳定同位素内标进行基质补偿"]
        N43 -.->|"重置分析方案"| Reset(["返回 Step 0"])
        N44 -.->|"重置分析方案"| Reset
    end

    N42 -->|"是：进入采集统筹"| NextStep(["进入 Step 5: 采集统筹"])

    class N42 decision;
    class NextStep,Reset milestone;
    style Step4 fill:#fcfcfc,stroke:#b2babb,stroke-width:1.5px,stroke-dasharray: 4 4,rx:10,ry:10;

本节重点介绍如何利用柱后输注法（Post-column infusion）评价基质效应。该技术合并了 Infusion 和 On-column 进样：注射泵恒定输注目标物纯标溶液，同时液相端进样空白基质提取液（或纯溶剂），两路流体经三通接头混合后引入质谱。

graph LR
    %% 样式挂载
    classDef hardware fill:#f9f9f9,stroke:#333,stroke-width:1.5px,rx:4,ry:4;
    classDef highlight fill:#e8f8f5,stroke:#1abc9c,stroke-width:1.5px,rx:4,ry:4;

    S[注射泵
Syringe Pump] -->|持续输注
目标物纯标溶液| T((三通接头
T-piece))
    LC[液相色谱泵
LC Pump] -->|运行方法梯度| Auto[自动进样器
Autosampler]
    Auto -->|进样：空白溶剂、空白基质| C[分析色谱柱
Analytical Column]
    C -->|含内源性杂质的
流动相洗脱液| T
    T -->|混合流路| MS[质谱离子源
MS Source]

    class S,LC,Auto,C,MS hardware;
    class T highlight;

进样空白溶剂时，由于梯度洗脱过程中，流动相组成的变化会影响分析物响应。因此，即使持续泵入恒定浓度的标准品，流出曲线依然会呈现为一条随流动相比例变化（可通过压力曲线反映）而平滑漂移的基线。

进样空白基质提取物时，通过与进样空白溶剂时的流出曲线比较，观察响应增强或减弱的区域，即为基质响应的干扰区。若出峰位置恰好与干扰区重合，需（1）调整色谱参数以避开该区域、（2）调整前处理方法、或（3）引入稳定同位素内标进行补偿。

Figure 1. Schematic diagram of the post-column infusion profile8

Step 5: 多通道采集方法建立

graph TD
    %% 样式挂载
    classDef default fill:#fff,stroke:#333,stroke-width:1px,rx:4,ry:4;
    classDef decision fill:#fff,stroke:#bf5b5b,stroke-width:1.5px;
    classDef milestone fill:#e8f8f5,stroke:#1abc9c,stroke-width:1.5px,rx:4,ry:4;

    subgraph Step5 ["Step 5: 多通道采集方法建立"]
        N51(["来自 Step 3/4"]) --> N51_Node["设定基础 MRM 参数：
配置 Dwell time、Pause time"]
        N51_Node --> N52{"常规 MRM 采集质量评估：
单峰采点数是否不少于 15 个"}
        N52 -->|"否，周期过长：引入 sMRM"| N53["配置 Scheduled MRM：
根据峰宽分配 Window width 缩短周期"]
        N53 --> N54{"sMRM 模式下采点数是否不少于 15 个"}
        N54 -->|"否，保留时间拥挤：调整色谱错开洗脱"| BackToStep3(["返回 Step 3 调整色谱"])
        N52 -->|"是，常规采点合规"| N55["多通道交叉干扰综合评估：
验证高浓度样本通道间互扰与内标纯度"]
        N54 -->|"是，sMRM 统筹成功"| N55
        N55 -->|"排查通过：锁定采集方案"| N56["输出最终 LC-MS/MS 采集方法"]
    end

    N56 --> NextStep(["进入 Step 6: 方法学验证"])

    class N52,N54 decision;
    class N56,NextStep milestone;
    style Step5 fill:#fcfcfc,stroke:#b2babb,stroke-width:1.5px,stroke-dasharray: 4 4,rx:10,ry:10;

当涉及到多个分析物或多个离子对 MRM 通道合并检测时，需要合理设置 Dwell time 和 Pause time，避免交叉串扰（Cross-talk）的同时，确保每个色谱峰至少有 15 个数据点。

注：以下内容来自《SCIEX-质谱使用教程：认识-SCIEX-5500-system》

Cycle Time

在 Figure 15 中，对于每个特定的质荷比，每次循环（如 0.5 s）只扫描一次，这个循环时间被称为 Cycle Time。Cycle Time 不仅包括电压变化的扫描时间，还包括系统复位准备好下一次扫描的暂停时间（Pause Time）。

Cycle Time 的设置，影响色谱峰能否被准确重复定量。我们知道，理想色谱峰为对称形正态分布曲线。只有获得足够的数据点来描绘色谱峰，才能准确重复定量，一个色谱峰一般至少需要采集 15–20 个数据点9。

因此，合适的 Cycle Time 可以按下式计算，数据点数一般取 15 足够：

\[ \text{Cycle Time} = \frac{\text{峰宽}}{\text{数据点数}} = \frac{\text{峰宽}}{15} \]

Dwell Time

Dwell Time 指在一个 Cycle Time 内，某一或某范围内质荷比的扫描时间。Dwell Time 越长，采集到的的离子信号越多，灵敏度也就越好；但 Dwell Time 过长，会使 Cycle Time 变大，导致采集不到足够的数据点来描绘一个色谱峰。

以 Q1 MI 为例，共扫描 3 个离子，每个离子的 Dwell Time 都是 20 ms，从扫描一个离子切换到另一个离子的 Pause Time 为 5 ms，那么 Cycle Time 为 75 ms。

\(m/z\) Dwell Time Pause time
192.10 20 ms 5 ms
210.12 20 ms 5 ms
256.45 20 ms 5 ms

Step 6: 方法验证

graph TD
    %% 样式挂载
    classDef default fill:#fff,stroke:#333,stroke-width:1px,rx:4,ry:4;
    classDef decision fill:#fff,stroke:#bf5b5b,stroke-width:1.5px;
    classDef milestone fill:#e8f8f5,stroke:#1abc9c,stroke-width:1.5px,rx:4,ry:4;

    subgraph Step6 ["Step 6: 基于 ICH M10 的方法验证"]
        N56(["来自 Step 5: 最终采集方法"]) --> N61{"方法预验证评估：
真实基质考察 LLOQ、线性、精密度"}
        N61 -->|"是，预验证达标：锁定方法"| N62["全套验证实施：
选择性、线性、最低定量限、准确度、精密度、
回收率、基质效应、稳定性、残留、ISR"]
        N61 -->|"否，预验证未达标：重新优化"| Reset(["返回 Step 0 重新优化"])
    end

    N62 --> End(["验证完成"])

    class N61 decision;
    class N62,End milestone;
    style Step6 fill:#fcfcfc,stroke:#b2babb,stroke-width:1.5px,stroke-dasharray: 4 4,rx:10,ry:10;

建议在进行全套方法验证前，先预验证真实基质中的 LLOQ、线性、精密度是否符合要求，正式验证按照 ICH M10 要求开展。

References

  1. 成功定量分析的经验与体会

  2. SCIEX Triple Quad 5500+ System System User Guide

  3. Siemiątkowska, A., Kosicka-Noworzyń, K., Karaźniewicz-Łada, M., Park, C., Gershkovich, P., & Kagan, L. (2025). Cross-Signal Contribution as a Challenge in LC-MS/MS Bioanalysis. Analytical Chemistry, 97(27), 14077–14087. https://doi.org/10.1021/acs.analchem.5c02508

  4. Turbo V Ion Source Operator Guide

  5. IonDrive Turbo V Ion Source Operator Guide

  6. Snyder, L. R., & Dolan, J. W. (2006). High‐Performance Gradient Elution: The Practical Application of the Linear‐Solvent‐Strength Model. John Wiley & Sons, Inc. https://doi.org/10.1002/0470055529

  7. Matuszewski, B. K., Constanzer, M. L., & Chavez-Eng, C. M. (2003). Strategies for the Assessment of Matrix Effect in Quantitative Bioanalytical Methods Based on HPLC−MS/MS. Analytical Chemistry, 75(13), 3019–3030. https://doi.org/10.1021/ac020361s

  8. Ye, J.-H., & Pao, L.-H. (2015). Using Visualized Matrix Effects to Develop and Improve LC-MS/MS Bioanalytical Methods, Taking TRAM-34 as an Example. PLOS ONE, 10(4), e0118818. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0118818

  9. Enough Data Points across a LC peak: https://www.agilent.com/cs/library/support/documents/FAQ_Approved_PDF_Template_enough_datapoints.pdf