酶促反应动力学

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酶动力学基本参数

米氏方程

1902 年 Victor Henri 提出了酶- 底物中间复合物学说，认为首先是酶 E 与底物 S 生成酶-底物 中间复合物 ES，然后 ES 分解生成产物 P 和游离的酶。

\[ \ce{E + S <=>[k_1][k_2] ES ->[k_3] E + P} \]

式中的 \(k_{1}\)、\(k_{2}\) 和 \(k_{3}\) 分别为各向反应的速率常数。

1913 年 Leonor Michaelis 和 Maud Menten 根据酶-底物复合物学说，经过大量实验，得出表示酶促反应动力学基本原理的数学表达式，即单底物浓度 \([S]\) 与酶反应速度 \(v\) 的定量关系，即著名的米-门二氏方程（Michaelis-Menten equation，也称米氏方程）。

\[ v = \frac{V_{max} [S]}{K_{m} + [S]} \]

  • \(v\) 指酶促反应的速率；
  • \(V_{max}\) 指酶促反应的最大反应速率；
  • \(K_{m}\) 是底物的米氏常数，\(K_{m} = \frac{k_{2}+k_{3}}{k_{1}}\)。

Figure 1. 底物浓度对酶促反应速率的影响

可知如下重要性质：

  • \(K_{m}\) 值等于酶促反应速率为最大反应速率一半时的底物浓度；
  • \(K_{m}\) 值是酶的特征性常数，\(K_{m}\) 值的大小并非固定不变，它与酶的结构、底物结构、反应环境的 pH、温度和离子强度有关，而与酶浓度无关；
  • \(K_{m}\) 在一定条件下可表示酶对底物的亲和力；
  • \(V_{max}\) 是酶被底物完全饱和时的反应速率。

酶动力学参数的测定

要测量 \(K_{m}\) 和 \(V_{max}\) 值，可以通过测量一系列不同底物浓度 \([S]\) 及对应的初始反应速率 \(v\)，然后使用林-贝作图法（Lineweaver-Burk plot）或直接拟合进行求解。

Lineweaver-Burk plot

将米氏方程的两边同时取倒数，有：

\[\frac{1}{v}=\frac{K_{m}}{V_{\max}}\cdot\frac{1}{[\mathrm{S}]}+\frac{1}{V_{\max}}\]

以 \(\frac{1}{v}\) 对 \(\frac{1}{[S]}\) 作图，纵轴上的截距为 \(\frac{1}{V_{max}}\)，横轴上的截距为 \(-\frac{1}{K_{m}}\)，称为林-贝作图法（Lineweaver-Burk plot）。

Figure 2. 林-贝作图法（Lineweaver-Burk plot）

抑制常数

\[ \ce{E + I <=> EI} \]

抑制常数（Inhibitory constant, \(K_i\)）即抑制剂-酶复合 EI 解离为游离酶 E 和抑制剂 I 的解离常数‌，\(K_i\) 反应抑制剂与酶的亲和力强度，\(K_i\) 越小，表明抑制剂与酶的亲和力越强。

\[ K_i=\frac{[E][I]}{[EI]} \]

\(K_i\) 在一定条件下（如特定的温度、pH 和缓冲液体系等）是常数，而与酶浓度 \([E]\) 和 抑制剂浓度 \([I]\) 无关，也与底物存在与否无关。

竞争性抑制

在竞争性抑制（Competitive Inhibition）中，抑制剂 I 与底物 S 竞争酶的同一个活性位点。抑制剂只能与游离的酶 E 结合，不能与酶-底物复合物 ES 结合。

所涉及的化学平衡如下：

  • \(\ce{E + S <=> ES -> E + P}\)
  • \(\ce{E + I <=> EI}\)

\[v = \frac{V_{max}[S]}{K_m \left( 1 + \frac{[I]}{K_i} \right) + [S]}\]

通过比较可以看出，竞争性抑制剂使表观米氏常数 \(K_m^{app}\) 增加了 \((1 + \frac{[I]}{K_i})\) 倍：

\[K_m^{app} = K_m \left( 1 + \frac{[I]}{K_i} \right)\]

，而 \(V_{max}\) 不变。

非竞争性抑制

在经典的非竞争性抑制（Non-competitive Inhibition）中，抑制剂 I 与底物 S 结合在酶的不同位点上。抑制剂既可以与游离酶 E 结合，也可以与酶-底物复合物 ES 结合，且结合能力相同。

所涉及的化学平衡如下：

  • \(\ce{E + S <=> ES -> E + P}\)
  • \(\ce{E + I <=> EI}\) （解离常数为 \(K_i\)）
  • \(\ce{ES + I <=> ESI}\) （解离常数为 \(K_i^{\prime}\)，且 \(K_i^{\prime} = K_i\)）
  • \(\ce{EI + S <=> ESI}\)

\[v = \frac{\frac{V_{max}}{1 + \frac{[I]}{K_i}}[S]}{K_m + [S]}\]

在这种情况下，\(K_m\) 不变，而表观最大反应速度 \(V_{max}^{app}\) 降低了：

\[V_{max}^{app} = \frac{V_{max}}{1 + \frac{[I]}{K_i}}\]

反竞争性抑制

在反竞争性抑制（Uncompetitive Inhibition）中，抑制剂 I 只能与酶-底物复合物 ES 结合，形成无活性的 ESI 复合物。

所涉及的化学平衡如下：

  • \(\ce{E + S <=> ES -> E + P}\)
  • \(\ce{ES + I <=> ESI}\) （解离常数为 \(K_i^{\prime}\)）

通过与竞争性抑制类似的代数变换，最终可以推导出反竞争性抑制下的米氏方程：

\[v = \frac{\frac{V_{max}}{1 + \frac{[I]}{K_i'}}[S]}{\frac{K_m}{1 + \frac{[I]}{K_i'}} + [S]}\]

在这种情况下，\(V_{max}\) 和 \(K_m\) 都受到了影响，它们都除以了同一个因子 \((1+\frac{[I]}{K_i'})\)。

\[V_{max}^{app} = \frac{V_{max}}{1 + \frac{[I]}{K_i'}} \quad \text{and} \quad K_m^{app} = \frac{K_m}{1 + \frac{[I]}{K_i'}}\]

混合型抑制

在混合型抑制（Mixed Inhibition）中，抑制剂不仅可以与游离的酶 E 结合，也可以酶-底物复合物 ES 结合，且抑制剂与这两种形式的酶的亲和力不同。

所涉及的化学平衡如下：

  • \(\ce{E + S <=> ES -> E + P}\)
  • \(\ce{E + I <=> EI}\) （解离常数为 \(K_i\)）
  • \(\ce{ES + I <=> ESI}\) （解离常数为 \(K_i^{\prime}\)，且 \(K_i^{\prime} \neq K_i\)）
  • \(\ce{EI + S <=> ESI}\)

混合型抑制的米氏方程：

\[ v=\frac{V_{max}\cdot[S]}{K_m(1+\frac{[I]}{K_i})+[S](1+\frac{[I]}{K_i^{\prime}})} \]

假设：

\[K_i^{\prime}=\alpha\cdot K_i\]

  • 如果 \(α>1\)，则 \(K_i^{\prime} > K_{i}\)​，表示抑制剂与游离酶的结合能力更强；
  • 如果 \(α<1\)，则 \(K_i^{\prime} < K_{i}\)​，表示抑制剂与酶-底物复合物的结合能力更强。

米氏方程整理为

\[v=\frac{V_{max}\cdot[S]}{K_m(1+\frac{[I]}{K_i})+[S](1+\frac{[I]}{\alpha K_i})}\]

表观最大反应速率 \(V_{max}^{app}\)：

\[V_{max}^{app}=\frac{V_{max}}{1+\frac{[I]}{K_i^{\prime}}}=\frac{V_{max}}{1+\frac{[I]}{\alpha K_i}}\]

由于抑制剂可以结合到 ES 复合物上形成无活性的 ESI 复合物，从而降低了有效催化复合物的浓度，因此表观最大反应速率 \(V_{max}^{app}\) 总是减小。

表观米氏常数 \(K_m^{app}\)：

\[K_m^{app}=K_m\frac{1+\frac{[I]}{K_i}}{1+\frac{[I]}{K_i^{\prime}}}=K_m\frac{1+\frac{[I]}{K_i}}{1+\frac{[I]}{\alpha K_i}}\]

\(K_m^{app}\) 的变化取决于抑制剂对 E 和 ES 的相对亲和力（即 \(α\) 的值）：

  • 如果抑制剂优先结合游离酶（\(α>1\)），则 \(K_m^{app}\) 增大（表观亲和力下降）。
  • 如果抑制剂优先结合酶-底物复合物（\(α<1\)），则 \(K_m^{app}\)​ 减小（表观亲和力上升）。

抑制常数的测量

基本思路

基本思路是，通过测量在不同底物浓度 \([S]\) 和不同抑制剂浓度 \([I]\) 条件下酶的反应速率 \(v\)，来观察抑制剂对酶动力学参数（\(V_{max}\) 和 \(K_{m}\)）的影响。

实验设计：设置一系列抑制剂浓度 \([I]\)，每一个固定的抑制剂浓度下，再设置一系列底物浓度 \([S]\) ，测量在不同底物浓度 \([S]\) 和不同抑制剂浓度 \([I]\) 条件下酶初始反应速率 \(v\)。

Table 1. 实验组设计示例

\([I]_0\) \([I]_1\) \([I]_2\) \([I]_3\)
\([S]_1\) \(v_{1,0}\) \(v_{1,1}\) \(v_{1,2}\) \(v_{1,3}\)
\([S]_2\) \(v_{2,0}\) \(v_{2,1}\) \(v_{2,2}\) \(v_{2,3}\)
\([S]_3\) \(v_{3,0}\) \(v_{3,1}\) \(v_{3,2}\) \(v_{3,3}\)
\([S]_4\) \(v_{4,0}\) \(v_{4,1}\) \(v_{4,2}\) \(v_{4,3}\)
\([S]_5\) \(v_{5,0}\) \(v_{5,1}\) \(v_{5,2}\) \(v_{5,3}\)
\([S]_6\) \(v_{6,0}\) \(v_{6,1}\) \(v_{6,2}\) \(v_{6,3}\)
\([S]_7\) \(v_{7,0}\) \(v_{7,1}\) \(v_{7,2}\) \(v_{7,3}\)

结果分析

酶动力学参数

在不加抑制剂一组（\([I]=0\)）中，以不同底物浓度 \([S]\) 及对应的初始反应速率 \(v\)，使用林-贝作图法（Lineweaver-Burk plot）或直接拟合进行求解 \(K_{m}\) 和 \(V_{max}\) 值。

Lineweaver-Burk plot

固定抑制剂浓度，以 \(\frac{1}{v}\) 对 \(\frac{1}{[S]}\) 作图，连接得到一条直线，称为 Lineweaver-Burk plot；有几个抑制剂浓度，就可以得到几条直线。

Figure 3. Lineweaver-Burk plot

抑制类型 图形特征
竞争性抑制 所有直线相交于 \(x\) 轴上同一点
反竞争性抑制 所有直线互相平行
混合型抑制 所有直线相交于 \(x\) 轴负半轴和 \(y\) 轴构成的第二象限内
非竞争性抑制 所有直线相交于 \(x\) 轴的负半轴上某一点

Dixon plot

固定底物浓度，以初始速率的倒数 \(\frac{1}{v}\) 对抑制剂浓度 \([I]\) 作图，连接得到一条直线，称为 Dixon plot。有几个固定底物浓度，就可以得到几条直线。

抑制类型 图形特征 \(K_{i}\)
竞争性抑制 所有直线相交于第二象限 交点的横坐标的相反数
非竞争性抑制 所有直线相交于 \(x\) 轴的负半轴上 交点的横坐标的相反数
反竞争性抑制 所有直线平行 /
混合型抑制 所有直线相交于第二象限 交点的横坐标的相反数

Secondary plot

以 Lineweaver-Burk 图中得到的斜率（Sloop）对抑制剂浓度 \([I]\) 作图，连接得到一条直线，称为二级重绘图（Secondary plot）。

  • x 轴截距即为 \(-K_{i}\)​。
  • y 轴截距是在没有抑制剂（\([I]=0\)）时，Lineweaver-Burk 图的斜率，即 \(\frac{K_m}{V_{max}}\)。

Figure 4. 抑制常数测量示例：(A) Lineweaver-Burk plot, (B) Secondary plot, and (C) Dixon plot

附：Cheng-Prusoff 方程

Cheng-Prusoff 方程可以将 \(IC_{50}\) 值转换成绝对抑制常数 \(K_{i}\)，使不同底物浓度下测量的 \(IC_{50}\) 具有可比性。

抑制类型 \(IC_{50}\) 与 \(K_i\) 的关系 \(IC_{50}\) 如何随 \([S]\) 变化
竞争性抑制 \(K_i = \frac{IC_{50}}{1 + \frac{[S]}{K_{m}}}\) 增大
非竞争性抑制 \(K_i = IC_{50}\) 不变
反竞争性抑制 \(K_i = \frac{IC_{50}}{1 + \frac{K_{m}}{[S]}}\) 减小
混合型抑制 \(IC_{50}=\frac{K_m+[S]}{\frac{K_m}{K_i}+\frac{[S]}{K_i^{\prime}}}\) 增大或减小

注：对混合型抑制，设 \(K_i^{\prime}=\alpha\cdot K_i\)，有 \(IC_{50}=\frac{K_m+[S]}{\frac{K_m}{K_i}+\frac{[S]}{\alpha K_i}}=K_i\cdot\frac{\alpha(K_m+[S])}{\alpha K_m+[S]}\)。

Cheng-Prusoff 方程也可用于计算 \(K_{i}\)。在已知动力学参数（\(K_{m}\)）及抑制剂抑制类型下，可以用 \(IC_{50}\) 及对应的 \([S]\) 计算 \(K_{i}\)。

半数抑制浓度

半数抑制浓度（\(IC_{50}\)） 指抑制 50% 给定生物过程或生物成分时抑制剂的浓度。

对抑制率 % 有：

\[ \text{\% } \text{Inhibition} = \frac{[I]^{n}}{K_{i}^{n}[I]^{n}} \]

以抑制剂浓度 \([I]\) 对 \(\text{\% } \text{Inhibition}\) 作图，曲线呈 S 形。\(IC_{50}\) 指 \(\text{\% } \text{Inhibition} = 50\%\) 时的 \([I]\)。

Figure 5. 浓度和抑制率 % 曲线

\(IC_{50}\) 的测量

以酶活实验为例，在固定的酶浓度和底物浓度（通常在 \(K_{m}\) 值附近，此时反应最敏感）下，通过测量一系列不同抑制剂浓度 \([I]\) 及对应的 \(\text{\% } \text{Inhibition}\)，然后进行拟合求解。

References

  1. 高国全, 汤其群. 生物化学与分子生物学 [M]. 第10 版. 北京：人民卫生出版社, 2024.

  2. Google Gemini with 2.5 Pro

  3. By Athel cb - Own work, CC BY-SA 4.0, https://commons.wikimedia.org/w/index.php?curid=130486959 (Figure 3)

  4. Identification, crystallization, and first X-ray structure analyses of phenyl boronic acid-based inhibitors of human carbonic anhydrase-II: https://doi.org/10.1016/j.ijbiomac.2024.131268 (Figure 4)

  5. By Blunder M, Hurkes N, Spirk S, List M, Pietschnig R - Bioorganic & medicinal chemistry letters (2010) - https://openi.nlm.nih.gov/detailedresult?img=PMC3013380_gr2&req=4, CC BY 3.0, https://commons.wikimedia.org/w/index.php?curid=138731109 (Figure 5)