使用血球计数板进行细胞计数
血球计数板
血球计数板用优质厚玻璃制成，通过 H 形凹槽分为两个相同的计数池。每个计数池的两侧都有一个支持柱，上面覆盖着特制的盖玻片，形成高度为 0.10 mm 的计数池。
计数池内划分为长和宽各为 3 mm 的方格，总共分为 9 个大方格。每个大格面积为 1.0 mm，体积为 0.1 mm3，即一个大方格的体积是 0.1 μL。
Western Blot 实验操作 03：转膜、染色和成像
转膜
材料
- 转印缓冲液（含有 20% 甲醇的 1X Tris-甘氨酸缓冲液）
| 试剂 | 用量 | 终浓度 |
|---|---|---|
| 10X Tris-甘氨酸缓冲液 | 100 mL | 1X |
| 甲醇 | 200 mL | 20% (V/V) |
| 去离子水 | to 1000 mL |
甲醇能减少凝胶的膨胀并提高蛋白质与硝酸纤维素膜的结合效率。转膜效率受以下因素影响：电泳缓冲液中是否存在 SDS、转膜缓冲液的 pH 及转膜前凝胶中的蛋白质是否已染色。为最大限度地提高转膜效率，SDS 的浓度不应超过 0.1%，转膜缓冲液 pH 必须 ≥8.0。
Western Blot 实验操作 02：上样和跑胶
SDS-PAGE 凝胶制备
材料
- 30% 丙烯酰胺/N,N'-亚甲基双丙烯酰胺混合液（29∶1, m/m）
- 10% 过硫酸铵（APS, m/V）
- 10% SDS 溶液
- 四甲基乙二胺（TEMED）
- 1.5 M Tris-HCl（pH8.8）
- 1.0 M Tris-HCl（pH6.8）
- 去离子水
- 异丙醇（或 70% 乙醇或水饱和丁醇）
设备
- 垂直电泳槽
Western Blot 实验操作 01：样品准备
细胞裂解和蛋白提取
材料
- 哺乳动物悬浮或单层生长的细胞样品或组织样品
- 裂解缓冲试剂
- 蛋白酶抑制剂 Cocktail（如品牌：YEASEN InStab™，货号/型号：20124ES03）
- 磷酸酶抑制剂 Cocktail（如品牌：YEASEN InStab™，货号/型号：20109ES05）
设备
- 高效匀浆器（匀浆组织时选用）
- 高速冷冻离心机
RT-qPCR 实验操作（全）
总 RNA 提取
材料
- 悬浮或单层生长的细胞样品或组织样品
- 氯仿或1-溴-3-氯丙烷（氯仿，品牌：Greagent，型号/货号：G75915B）
溴氯丙烷是一种可取的氯仿替代物，因为它毒性更小且不易挥发。此外，溴氯丙烷可以提供更好的液相分离，从而更好地从总 RNA 中去除基因组 DNA，获得更纯的 RNA。
- 异丙醇（异丙醇，品牌：Greagent，型号/货号：G75885B）
- 糖原（20 mg/mL 储存液）（可选）
- 无 RNase 的水（DEPC 水，品牌：Beyotime，型号/货号：R0022）
- 乙醇（无水乙醇，品牌：Greagent，型号/货号：G73537AC）
- 75% 乙醇（用无水乙醇和 DEPC 水配制）
- 单相裂解试剂（如 TRIzol）（TriQuick Reagent 总 RNA 提取试剂，品牌：Solarbio，型号/货号：R1100）
- 磷酸盐缓冲液（PBS）（1X）（PBS 缓冲液，品牌：Solarbio，型号/货号：P1020）
2025 的新年愿望
- 每周更新一篇推文，保持写作和记录习惯；
- 合理安排时间，早睡早起，每周至少 4 天在 24:00 前睡觉；
- 必须参加 IELTS，并 ≥ 7.0；
- 对专业知识有系统的了解，对相关法规有较全面的认识；
- 锻炼，控制 BMI ≤ 22.0；
- 系统学习摄影知识；
- “宁可痛苦，不要麻木”，常留点时间思考，静下心来看几本书和几部电影；
- 多向外索取，表达是方式，而不是目的；
- 及时行动，勇敢不要犹豫。
动物实验给药剂量及溶剂选择
实验动物相关生理参数
Table 1. Relevant physiological parameters for different animals1
| Animal species | Weight (kg) | Blood volume (mL) | Blood flow (mL/min) | Total surface area (m^2) | Life-span (year) | Normal oral (mL/kg) | Normal i.v. (mL/kg) |
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| Mouse | 0.02 | 1.7 | Liver: 1.8; kidney: 1.3 | 0.008 | 2.7 | 10 | 5 |
| Rat | 0.25 | 13.5 | Liver: 13.8; kidney: 9.2 | 0.023 | 4.7 | 5–10 | 2.5 |
| Rabbit | 2.5 | 165 | Liver: 177; kidney: 80 | 0.17 | 8.0 | 5–10 | 1–2 |
| Rhesus monkey | 5 | 367 | Liver: 218; kidney: 138 | 0.32 | 22 | 5–8 | 0.5–1 |
| Dog | 10 | 900 | Liver: 309; kidney: 216 | 0.51 | 20 | 5–8 | 0.5–1 |
不同途径推荐给药体积
Table 2. Recommended Dose Volumes for Common Laboratory Animals2
RT-qPCR 实验操作（四）：结果分析
数据要求
反应结束后需要确认扩增曲线及熔解曲线，标准扩增曲线为 S 型，熔解曲线呈单峰；
Ct 值介于 20–30 之间时，定量分析最准确；Ct 值小于 10 时，需要将稀释模板后，重新进行实验；Ct 值介于 30–35 之间时，需要提高模板浓度，或者增大反应体系的体积，以提高扩增效率，保证结果分析的准确性；Ct 值大于 35 时，检测结果无法定量分析基因的表达量，但可用于定性分析。
定量实验至少需要三个生物学重复；所有复孔间的差别应该在 0.5 Ct 内；在 35 个循环以后，Ct 值变化较大，定量结果可能不太可靠。
标准扩增曲线为 S 型，如下图：
PCR 前期，目的 DNA 以指数形式扩增，这一扩增时期称为指数期（Exponential phase）；PCR 后期，由于引物和 dNTP 等反应底物的减少，目的 DNA 片段扩增的速度变慢，直至停止，这一扩增时期称为平台期（Plateau phase）。qPCR 过程中，荧光值随着目的 DNA 的扩增而增加，当荧光值达到阈值时的循环数称为 Ct 值，Ct 值越小，说明目的 DNA 的初始浓度越大。
RT-qPCR 实验操作（三）：两步法 RT-qPCR
反转录
材料
- 已测定浓度的总 RNA 样品
- PrimeScript™ RT Master Mix (Perfect Real Time)（品牌：TaKaRa，型号/货号：RR036A）
It contains a 5X pre-mixed reagent containing all of the components needed for quantitative RT-PCR reverse transcription (PrimeScript RTase, RNase Inhibitor, Random 6 mers, Oligo dT Primer, dNTP Mixture, and reaction buffer), and a reaction can be started simply by adding template RNA and water.
- RNase Free dH2O（PrimeScript™ RT Master Mix 内置）
- 微量离心管（0.2 mL）（PCR 单管，品牌：A-gen，型号/货号：PCR-02）
RT-qPCR 实验操作（二）：RNA 定量和储存
RNA 定量
材料
- 适当稀释的总 RNA 样品
- 空白检测溶液（如 TE（pH 8.0）、无 RNase 的水等）
- 无尘纸
设备
- 微量分光光度计