Western Blot 实验操作 01：样品准备
细胞裂解和蛋白提取
材料
- 哺乳动物悬浮或单层生长的细胞样品或组织样品
- 裂解缓冲试剂
- 蛋白酶抑制剂 Cocktail（如品牌：YEASEN InStab™，货号/型号：20124ES03）
- 磷酸酶抑制剂 Cocktail（如品牌：YEASEN InStab™，货号/型号：20109ES05）
设备
- 高效匀浆器（匀浆组织时选用）
- 高速冷冻离心机
RT-qPCR 实验操作（全）
总 RNA 提取
材料
- 悬浮或单层生长的细胞样品或组织样品
- 氯仿或1-溴-3-氯丙烷（氯仿，品牌：Greagent，型号/货号：G75915B）
溴氯丙烷是一种可取的氯仿替代物，因为它毒性更小且不易挥发。此外，溴氯丙烷可以提供更好的液相分离，从而更好地从总 RNA 中去除基因组 DNA，获得更纯的 RNA。
- 异丙醇（异丙醇，品牌：Greagent，型号/货号：G75885B）
- 糖原（20 mg/mL 储存液）（可选）
- 无 RNase 的水（DEPC 水，品牌：Beyotime，型号/货号：R0022）
- 乙醇（无水乙醇，品牌：Greagent，型号/货号：G73537AC）
- 75% 乙醇（用无水乙醇和 DEPC 水配制）
- 单相裂解试剂（如 TRIzol）（TriQuick Reagent 总 RNA 提取试剂，品牌：Solarbio，型号/货号：R1100）
- 磷酸盐缓冲液（PBS）（1X）（PBS 缓冲液，品牌：Solarbio，型号/货号：P1020）
2025 的新年愿望
- 每周更新一篇推文，保持写作和记录习惯；
- 合理安排时间，早睡早起，每周至少 4 天在 24:00 前睡觉；
- 必须参加 IELTS，并 ≥ 7.0；
- 对专业知识有系统的了解，对相关法规有较全面的认识；
- 锻炼，控制 BMI ≤ 22.0；
- 系统学习摄影知识；
- “宁可痛苦，不要麻木”，常留点时间思考，静下心来看几本书和几部电影；
- 多向外索取，表达是方式，而不是目的；
- 及时行动，勇敢不要犹豫。
动物实验给药剂量及溶剂选择
实验动物相关生理参数
Table 1. Relevant physiological parameters for different animals1
| Animal species | Weight (kg) | Blood volume (mL) | Blood flow (mL/min) | Total surface area (m^2) | Life-span (year) | Normal oral (mL/kg) | Normal i.v. (mL/kg) |
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| Mouse | 0.02 | 1.7 | Liver: 1.8; kidney: 1.3 | 0.008 | 2.7 | 10 | 5 |
| Rat | 0.25 | 13.5 | Liver: 13.8; kidney: 9.2 | 0.023 | 4.7 | 5–10 | 2.5 |
| Rabbit | 2.5 | 165 | Liver: 177; kidney: 80 | 0.17 | 8.0 | 5–10 | 1–2 |
| Rhesus monkey | 5 | 367 | Liver: 218; kidney: 138 | 0.32 | 22 | 5–8 | 0.5–1 |
| Dog | 10 | 900 | Liver: 309; kidney: 216 | 0.51 | 20 | 5–8 | 0.5–1 |
不同途径推荐给药体积
Table 2. Recommended Dose Volumes for Common Laboratory Animals2
RT-qPCR 实验操作（四）：结果分析
数据要求
反应结束后需要确认扩增曲线及熔解曲线，标准扩增曲线为 S 型，熔解曲线呈单峰；
Ct 值介于 20–30 之间时，定量分析最准确；Ct 值小于 10 时，需要将稀释模板后，重新进行实验；Ct 值介于 30–35 之间时，需要提高模板浓度，或者增大反应体系的体积，以提高扩增效率，保证结果分析的准确性；Ct 值大于 35 时，检测结果无法定量分析基因的表达量，但可用于定性分析。
定量实验至少需要三个生物学重复；所有复孔间的差别应该在 0.5 Ct 内；在 35 个循环以后，Ct 值变化较大，定量结果可能不太可靠。
标准扩增曲线为 S 型，如下图：
PCR 前期，目的 DNA 以指数形式扩增，这一扩增时期称为指数期（Exponential phase）；PCR 后期，由于引物和 dNTP 等反应底物的减少，目的 DNA 片段扩增的速度变慢，直至停止，这一扩增时期称为平台期（Plateau phase）。qPCR 过程中，荧光值随着目的 DNA 的扩增而增加，当荧光值达到阈值时的循环数称为 Ct 值，Ct 值越小，说明目的 DNA 的初始浓度越大。
RT-qPCR 实验操作（三）：两步法 RT-qPCR
反转录
材料
- 已测定浓度的总 RNA 样品
- PrimeScript™ RT Master Mix (Perfect Real Time)（品牌：TaKaRa，型号/货号：RR036A）
It contains a 5X pre-mixed reagent containing all of the components needed for quantitative RT-PCR reverse transcription (PrimeScript RTase, RNase Inhibitor, Random 6 mers, Oligo dT Primer, dNTP Mixture, and reaction buffer), and a reaction can be started simply by adding template RNA and water.
- RNase Free dH2O（PrimeScript™ RT Master Mix 内置）
- 微量离心管（0.2 mL）（PCR 单管，品牌：A-gen，型号/货号：PCR-02）
RT-qPCR 实验操作（二）：RNA 定量和储存
RNA 定量
材料
- 适当稀释的总 RNA 样品
- 空白检测溶液（如 TE（pH 8.0）、无 RNase 的水等）
- 无尘纸
设备
- 微量分光光度计
RT-qPCR 实验操作（一）：从哺乳动物的细胞和组织中提取总 RNA
材料
- 悬浮或单层生长的细胞样品或组织样品
- 氯仿或1-溴-3-氯丙烷
溴氯丙烷是一种可取的氯仿替代物，因为它毒性更小且不易挥发。此外，溴氯丙烷可以提供更好的液相分离，从而更好地从总 RNA 中去除基因组 DNA，获得更纯的 RNA。
- 乙醇（75%），用焦碳酸二乙酯（DEPC）处理的水配制
- 糖原（20 mg/mL 储存液）（可选）
- 异丙醇
- 单相裂解试剂（如 TRIzol）
- 磷酸盐缓冲液（PBS）（1X）
- 无 RNase 的水
设备
小鼠尾静脉注射技巧
前言
尾静脉注射是小鼠实验最常见的给药方式之一，也是较难掌握的小鼠实验技能。我在很长一段时间内，也是一直没有掌握到实验精髓。
在早期实验条件差的时候，我们都是先把小鼠麻醉，然后用 250 mL 或是 500 mL 的烧杯扣住，把小鼠的尾巴从杯嘴漏出来，接着用 1 mL 注射器给药。在如此条件下，我们实验室历史上仍然有两三个人能取得较高的成功率，每一位一到实验都是炙手资源，可谓是实验的大救星。我本人也曾尝试努力钻研相关技巧，一度能达到尾静脉注射 C57 有近 50% 的成功率，甚至颇为自豪，可惜的是一个月后的才开始正式实验，生疏许久之后手感全无，无奈最后还是请来帮手。至此，只能放弃认命，而我提升实验室地位的尝试也就此失败。
后来到了一个新实验室，老板斥资买了一个小鼠尾静脉注射仪，摸索了一下，发现相当实用，熟练后一针成功率估计有 80%，两针基本都能打进，不经感叹“科技改变生活”。很早以前在网上听过某个老师讲一句话，大意是“科研 = IT = Ideas + Tools”，如今想来，感慨万千，不经潸然泪下。
小鼠尾巴结构
OpenWrt 开启 IPv6 中继
最近换了个路由器，不过只能刷 OpenWrt 固件。我之前用的都是 Padavan，几乎可以一键配置 IPv6，加上有 IPv6 公网，非常方便我在外使用远程桌面。不过换成 OpenWrt 后，前后折腾了一个多星期，才搞定了 OpenWrt IPv6 中继。
这里稍微介绍一些 IPv6 基础知识，同时记录一下 OpenWrt 开启 IPv6 中继实现过程。
IPv6 基础知识
IPv6 地址规范
IPv6 地址的长度为 128 bits（2128），由八组 16 位字段组成，相邻字段用冒号分隔，如：