液相色谱柱
色谱柱基本结构
Figure 1. 液相色谱柱
常见的 HPLC 色谱柱由不锈钢柱体和两端的筛板（frit），以及柱内填料组成。两端的筛板主要防止填充颗粒流失和色谱柱堵塞；对于分配色谱，填料通常以硅胶颗粒作为载体，在硅胶表面键合有固定相。
Figure 2. 色谱柱的基本结构
填料特征
颗粒类型
硅胶颗粒能够提供较高的机械强度，同时硅胶可以与不同的固定相键合，提供不同的分离能力。分配色谱的填料，通常使用硅胶作为载体。
常用的硅胶颗粒有两种形状：全多孔颗粒（Porous particle）和表面多孔颗粒（Superficially porous particle）。
Figure 3. 全多孔颗粒（Porous particle）和表面多孔颗粒（Superficially porous particle）示意图
表面多孔颗粒有一个坚硬的内核，而外表面多孔。这些颗粒一般是 2–5 µm，孔外壳的厚度一般是 0.25–0.5 µm。相较于全多孔颗粒，能够减小的涡流扩散、纵向扩散，以及明显减小传质阻抗，因此能提供更大的塔板数值。现在色谱柱多用表面多孔颗粒。
颗粒尺寸和孔径
填料颗粒尺寸会影响色谱柱的保留能力。颗粒尺寸减小，涡流扩散和传质阻抗也会减小，因此能提供更大的塔板数值。过去常用粒径 5 µm 填料的色谱柱，现在也常用 3 µm 或更小粒径的柱子，以减少分离时间。但粒径越小的色谱柱，背压也会越大。
注：色谱柱压力符合
\[ P\approx\frac{\phi^{\prime}\cdot\eta\cdot L\cdot F}{A\cdot d_p^2} \]
- \(P\)：压力；
- \(\phi^{\prime}\)：流动阻力因子，取决于色谱柱内填充床的特性，包括填料颗粒的形状和填充的均匀性与密度；
- \(\eta\)：流动相的动力粘度；
- \(L\)：色谱柱长度；
- \(F\)：流动相流速；
- \(A\)：色谱柱的横截面积；
- \(d_{p}\)：填料颗粒直径。
相比率指一根色谱柱中固定相的体积与流动相的体积之比：\(\phi=\frac{V_S}{V_M}\)， \(\Psi\) 大致上和表面积成正比，保留时间和 \(\Psi\) 成正比；因此当孔径减小时，表面积增大，保留时间也会增加。
然而颗粒孔径并非越小越好，溶剂分子必须能够无障碍地浸入孔径，因此要求孔径要大于溶剂分子。对于分子量 < 5000 Da 的化合物而言，平均孔径应该最好保持在 9 nm 甚至更大。较大的分子需要较大的孔径；比如说，蛋白分子一般需要 30 nm 孔径的颗粒来分离。
键合固定相
柱子的固定相决定了保留时间和选择性。硅胶颗粒表面覆盖着大量硅醇基（\(\text{≡Si-OH}\)），通过与硅烷化试剂（如：十八烷基氯硅烷）反应，将需要引入的固定相键合在硅胶颗粒表面。
\(≡\text{Si–OH} + \text{Cl–Si}(\text{CH}_2)_2\text{–}(\text{CH}_2)_{17}\text{CH}_3 \rightarrow ≡\text{Si–O–Si}(\text{CH}_2)_2\text{–}(\text{CH}_2)_{17}\text{CH}_3 + \text{HCl}\)
单体固定相（Monomeric Phase）：使用单官能团的硅烷试剂（如上面例子中的 \(\text{Cl-Si(CH}_{3}\text{)}_{2}\text{-R}\)，只有一个 \(\text{Cl}\) 反应位点）与一个硅醇基“一对一”键合。
聚合固定相（Polymeric Phase）：使用双官能团或三官能团的硅烷试剂（如 \(\text{Cl}_{2}\text{-Si(CH}_{3}\text{)}\text{-R}\) 或 \(\text{Cl}_{3}\text{-Si-R}\)），能够同时与 2 个或 3 个硅醇基键合；在有微量水存在时，自身之间也会发生交联聚合。
Figure 4. (a) 单体固定相，(b) 聚合固定相
Figure 5. 自身交联聚合的聚合固定相
封端
当硅烷化试剂与一个硅醇基键合，较大的空间体积会阻碍邻近的硅醇基与其他烷基化试剂反应，硅胶表面仍然会存在没有反应的硅醇基。
为了减小硅醇基对分析物的保留（如对弱碱性化合物造成拖尾），反向色谱柱的填料通常需要封端（endcapped），通过将硅醇基和一个较小的烷基化试剂进一步反应来实现，比如与三甲基氯硅烷或者二甲基二氯硅烷。
封端能减少裸露的硅烷醇基，不能完全将硅醇基去除。同时，较小的固定相（如封端的三甲基硅烷）在低 pH 下更容易被水解和破坏，这会造成保留时间和选择性的改变。另一方面，封端的柱子在中等的较高的 pH 下更加稳定。
Figure 6. 使用 TMS 进行封端
键合相侧链空间位阻保护
在低 pH 下，水合氢离子（\(\text{H}_{3}\text{O}^{+}\)）会进攻连接固定相和硅胶颗粒的硅氧烷键，导致其水解断裂，固定相流失。因此，可以在侧链引入大位阻的基团，以防止水解发生，使色谱柱能够在低 pH 下使用。
Figure 7. (a) 无侧链空间位阻保护的硅胶颗粒，(b) 进行侧链空间位阻保护的硅胶颗粒
杂化
当流动相的 pH > 8 时，构成硅胶骨架的硅氧烷键（\(\text{–Si–O–Si–}\)）会发生水解，导致硅胶基质溶解。以 Waters 公司为代表，发展了杂化颗粒技术，通过将有机基团（通常是乙基或甲基）引入到二氧化硅的网状骨架中，不仅提升了色谱柱 pH 耐用范围（如 BEH 颗粒的 pH 范围可达 1–12），同时也拥有更好的机械强度。
Figure 8. 亚乙基桥杂化（BEH）颗粒
References
LloydR.Snyder,JosephJ.Kirkland,JohnW.Dolan,等.现代液相色谱技术导论[J].人民卫生出版社, 2012.