Western Blot 实验操作 03：转膜、染色和成像
转膜
材料
- 转印缓冲液（含有 20% 甲醇的 1X Tris-甘氨酸缓冲液）
| 试剂 | 用量 | 终浓度 |
|---|---|---|
| 10X Tris-甘氨酸缓冲液 | 100 mL | 1X |
| 甲醇 | 200 mL | 20% (V/V) |
| 去离子水 | to 1000 mL |
甲醇能减少凝胶的膨胀并提高蛋白质与硝酸纤维素膜的结合效率。转膜效率受以下因素影响：电泳缓冲液中是否存在 SDS、转膜缓冲液的 pH 及转膜前凝胶中的蛋白质是否已染色。为最大限度地提高转膜效率，SDS 的浓度不应超过 0.1%，转膜缓冲液 pH 必须 ≥8.0。
- 转印膜（硝酸纤维素膜或 PVDF 膜）
- 海绵、滤纸
- 去离子水
- 漂洗缓冲液（常用 TBST）
| 试剂 | 用量 | 终浓度 |
|---|---|---|
| 10X TBS | 100 mL | 1X |
| Tween 20 | 1 mL | 0.1% (m/V) |
| 去离子水 | to 1000 mL |
设备
- 转印夹
- 赶气泡滚
- 转膜槽
- 平板摇床
- 孵育盒
方法
根据所用蛋白凝胶体系，制备转印缓冲液。
取出凝胶进行修剪，裁去加样孔部分。
裁剪一张比凝胶稍大的转印膜，并按照生产商的说明书对转印膜进行预处理。
- 硝酸纤维素膜：直接在转印缓冲液中平衡 5 min。
- PVDF 膜：在甲醇或乙醇（100％）中预先润湿 15 s，使用去离子水短暂漂洗，然后在转印缓冲液中平衡 5 min。
- 尼龙膜：直接在转印缓冲液中平衡 5 min，更常用于核酸转印。
Western Blot 膜通常以片状或卷状提供，通常厚度为 100 µm，典型孔径为 0.1、0.2 或 0.45 µm。大多数蛋白质可以使用 0.45 µm 孔径的膜成功印迹，而对于低分子量蛋白质或多肽 (<20 kDa)，建议使用 0.1 或 0.2 µm 孔径的膜。
| 特性 | 结合相互作用 | 结合能力 | 优点 | 缺点 | |
|---|---|---|---|---|---|
| 硝酸纤维素 | 可以去标记和重新标记 | 疏水和静电 | 80−100 µg/cm2 | 背景较低 | 具有脆性且易碎，限制了去标记和重新标记的使用 |
| PVDF | 可以去除标记和重新标记 | 疏水 | 170−200 µg/cm2 | 通常比硝酸纤维素更耐用 | 使用前必须先用甲醇或乙醇浸湿 |
| 尼龙 | 可以去除标记和重新标记 | 离子、疏水和静电 | 480 µg/cm2 | 高耐用性 | 与强阴离子有更高的非特异性结合，非特异性背景高 |
将修剪后的凝胶在转印缓冲液平衡 10−30 min。
在转印缓冲液中浸润海绵、滤纸。
按负极（黑色一侧）→海绵→三层滤纸→凝胶→转印膜→三层滤纸→海绵→正极（红色或透明），组装好转印夹，构建“转印三明治” 。
务必保证各层之间没有气泡，可以尝试使用赶气泡滚。
Figure 1. 转印夹
Figure 2. 转印三明治示意图。三明治结构浸泡在转膜缓冲液中，对其施加电场，负电荷蛋白向正极移动，结合在膜上，并阻止其继续移动。
- 将组装好的转印夹放入转膜槽中，倒入电泳缓冲液，电泳液需没过膜的高度；将转膜槽置于冰上，正确接好电源正负极，按合适的条件，开始进行转膜。
转膜条件建议参考厂商说明，如 Transfer Conditions | Bio-Rad ；常见的转膜条件为 100 V, 1−2 h 或 30 V 过夜（~16 h）。
- 蛋白转印结束后，将膜在去离子水中摇动漂洗 4 次，每次 5 min，以去除所有转印缓冲液。
染色
材料
- 漂洗缓冲液（常用 TBST）
| 试剂 | 用量 | 终浓度 |
|---|---|---|
| 10X TBS | 100 mL | 1X |
| Tween 20 | 1 mL | 0.1%（m/V） |
| 去离子水 | to 1000 mL |
- 封闭缓冲液（1%−5% 脱脂奶粉或 BSA in TBST）
- 特异性一抗
内参抗体的选择可以参考 WB内参抗体（Loading control ）选择指南。
- HRP 偶联的二抗
宿主种属：二抗特异性地结合在生成一抗的宿主种属的 IgG 上。例如，如果您的一抗来自兔，那么您需要选择在除兔以外的其他宿主种属中培养的兔二抗（例如驴抗兔二抗）。
抗体种类/亚类：二抗必须抗一抗的同种型。多克隆一抗通常来源于兔、山羊、绵羊或驴，且通常是 IgG 同种型。因此，二抗通常是抗 IgG H&L（重链 & 轻链）抗体。单克隆一抗通常来源于小鼠、兔和大鼠。例如，若单克隆一抗是小鼠 IgG1，那么您需要使用抗小鼠 IgG 或特异性较弱的抗小鼠 IgG 的 F(ab) 片段。
- ECL 试剂盒
设备
- 赶气泡滚
- 平板摇床
- 孵育盒
方法
封闭
封闭膜可以阻碍一抗和/或二抗非特异性的结合到膜上（膜对蛋白有很高的结合能力，因此对抗体也有很高的结合能力）。
使用足量封闭缓冲液摇动孵育膜。
- 对于荧光蛋白质印迹，在室温下轻轻摇动孵育 1 h。
- 对于化学发光蛋白质印迹，将膜在 4 °C 下轻轻摇动孵育过夜，或在室温下孵育 1 h。
推荐使用 3% 脱脂奶粉或 5% BSA（使用漂洗缓冲液配制）作为封闭液，也有使用 1% 或 5% 的脱脂奶粉。脱脂奶粉封闭全面，但含有的酪蛋白会影响磷酸化蛋白的分析；无论是脱脂奶粉还是 BSA 均建议过滤使用，不过滤可能会导致斑点，在显影时影响条带。
一抗孵育
- 按照供应商的建议，使用封闭缓冲液稀释一抗。
抗体的稀释倍数可能需要优化；使用更低浓度的封闭缓冲液（如 1% 脱脂奶粉或 3% BSA）配制抗体，可能获得更好的效果。
将膜上结合蛋白的一面朝上置于一抗溶液中，在室温下摇动孵育 1 h，或在 4 °C 下孵育过夜。确保抗体溶液可完全覆盖转印膜。
使用漂洗缓冲液摇动漂洗膜共 3 次，每次 5 min。
二抗孵育
- 使用适量漂洗缓冲液或封闭缓冲液稀释辣根过氧化物酶（HRP）偶联的二抗。
抗体的稀释倍数可能需要优化；此外，使用更低浓度的封闭缓冲液（如 1% 脱脂奶粉或 3% BSA）配制抗体，可能获得更好的效果。
将膜上结合蛋白的一面朝上置于二抗溶液中，在室温下摇动孵育 1 h。确保抗体工作液可完全覆盖转印膜。
使用漂洗缓冲液摇动漂洗膜共 3 次，每次 5 min，以去除所有未结合的二抗。在这步操作中，是否对膜进行了充分的漂洗至关重要。
成像
材料
- ECL 试剂盒
设备
- 赶气泡滚
- 平板摇床
- 孵育盒
- 保鲜膜
- 成像系统
方法
对于 HRP 偶联的抗体，通常使用加强的化学发光（ECL）试剂盒作为底物。如果二抗是荧光偶联二抗，可以直接进入成像步骤。
- 在使用前，按照厂商的说明配制新鲜的 ECL 工作液，每 cm2 的膜大约需要 0.1 mL 工作溶液。
在 HRP 和过氧化物缓冲液的作用下，鲁米诺氧化并形成激发态产物，发出光线的同时逐渐衰变为基态。 因为只有在酶-底物反应过程中发射光线，一旦酶附近的底物耗尽，信号输出就会停止。
- 将转印膜与工作液共同孵育 1−5 min。
孵育时间可能需要优化。
将转印膜从工作液中取出并去除多余的液体。
将转印膜置于透明保鲜膜或文件保护膜上，使用赶气泡滚以去除气泡。
使用胶片或适当的成像系统进行印迹成像。为了清楚地检测与目标蛋白相关的条带，可能需要优化曝光时间，下列时间可以参考：
- 10 s
- 30 s
- 1 min
- 5 min（如果 1 min 不合适）
- 10 min
抗体剥离（可选）
如果需要，杂交产物可以从膜上剥离，因而可以使用其他的抗体进行再次检测。
材料
- 漂洗缓冲液（TBST）
- 抗体剥离液
| 试剂 | 用量 | 终浓度 |
|---|---|---|
| Tris-HCl（0.5 mol/L，pH6.7） | 12.4 mL | 62 mmol/L |
| SDS | 2 g | 2%（m/V） |
| β-巯基乙醇（14.2 mol/L） | 0.7 mL | 100 mmol/L |
| 去离子水 | to 100 mL |
于密闭的瓶子中室温保存。
设备
- 平板摇床
- 孵育盒
方法
将转印膜与抗体剥离液 50 °C 孵育 5−10 min。
先用大量去离子水冲洗，再用漂洗缓冲液洗膜至少 3 次，每次 10 min。
重新进行膜的封闭和检测。
References
(美)M.R.格林(Michael R. Green) (美)J. 萨姆布鲁克(Joseph.Sambrook) 主编, 贺福初 译. 分子克隆实验指南(原书第四版)(精装上下册)[M]. 分子克隆实验指南（原书第四版）（精装上下册）, 2017.
What is appropriate voltage settings for western blot transfer step?