Western Blot 实验操作 02：上样和跑胶
SDS-PAGE 凝胶制备
材料
- 30% 丙烯酰胺/N,N'-亚甲基双丙烯酰胺混合液（29∶1, m/m）
- 10% 过硫酸铵（APS, m/V）
- 10% SDS 溶液
- 四甲基乙二胺（TEMED）
- 1.5 M Tris-HCl（pH8.8）
- 1.0 M Tris-HCl（pH6.8）
- 去离子水
- 异丙醇（或 70% 乙醇或水饱和丁醇）
设备
- 垂直电泳槽
方法
配制
- 根据目标蛋白分子量，选择合适的分离胶浓度。
Table 1. 用于有效分离蛋白质的不同含量的丙烯酰胺
| 丙烯酰胺浓度/% | 分离线性范围/kDa |
|---|---|
| 15 | 10–43 |
| 12 | 12–60 |
| 10 | 20–80 |
| 7.5 | 36–94 |
| 5.0 | 57–212 |
- 按照生产厂商的说明组装电泳槽玻璃板。
确保组装好的玻璃板密封，可以通过加入去离子水进行检漏，测试通过后倒掉并用滤纸边缘移走任何残留的去离子水。
- 确定凝胶模具的体积（此信息一般由生产厂商提供）。参照 Table 2 配制分离胶溶液，按所示顺序加入相应试剂后混匀溶液。**一旦加入 TEMED 后，丙烯酰胺就会开始快速聚合。因此，应立即快速混匀混合液后，进行下一步操作。
过硫酸铵提供的自由基引发了丙烯酰胺和双丙烯酰胺的聚合反应。
TEMED 通过催化过硫酸铵自由基的形成加速丙烯酰胺和双丙烯酰胺的聚合。
由于氧气能够抑制丙烯酰胺溶液的聚合反应，因此在混匀混合液时应避免产生气泡。
Table 2. Tris-甘氨酸 SDS-PAGE 分离胶的制备方案
| 成分 | 5mL | 10mL | 15mL | 20mL | 25mL | 30mL | 40mL | 50mL |
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 6% 的胶 | ||||||||
| 水 | 2.6 | 5.3 | 7.9 | 10.6 | 13.2 | 15.9 | 21.2 | 26.5 |
| 30% 丙烯酰胺溶液（29:1） | 1.0 | 2.0 | 3.0 | 4.0 | 5.0 | 6.0 | 8.0 | 10.0 |
| 1.5 M Tris-HCl (pH8.8) | 1.3 | 2.5 | 3.8 | 5.0 | 6.3 | 7.5 | 10.0 | 12.5 |
| 10% SDS | 0.05 | 0.1 | 0.15 | 0.2 | 0.25 | 0.3 | 0.4 | 0.5 |
| 10% APS | 0.05 | 0.1 | 0.15 | 0.2 | 0.25 | 0.3 | 0.4 | 0.5 |
| TEMED | 0.004 | 0.008 | 0.012 | 0.016 | 0.02 | 0.024 | 0.032 | 0.04 |
| 8% 的胶 | ||||||||
| 水 | 2.3 | 4.6 | 6.9 | 9.3 | 11.5 | 13.9 | 18.5 | 23.2 |
| 30% 丙烯酰胺溶液（29:1） | 1.3 | 2.7 | 4.0 | 5.3 | 6.7 | 8.0 | 10.7 | 13.3 |
| 1.5 M Tris-HCl (pH8.8) | 1.3 | 2.5 | 3.8 | 5.0 | 6.3 | 7.5 | 10.0 | 12.5 |
| 10% SDS | 0.05 | 0.1 | 0.15 | 0.2 | 0.25 | 0.3 | 0.4 | 0.5 |
| 10% APS | 0.05 | 0.1 | 0.15 | 0.2 | 0.25 | 0.3 | 0.4 | 0.5 |
| TEMED | 0.003 | 0.006 | 0.009 | 0.012 | 0.015 | 0.018 | 0.024 | 0.03 |
| 10% 的胶 | ||||||||
| 水 | 1.9 | 4.0 | 5.9 | 7.9 | 9.9 | 11.9 | 15.9 | 19.8 |
| 30% 丙烯酰胺溶液（29:1） | 1.7 | 3.3 | 5.0 | 6.7 | 8.3 | 10.0 | 13.3 | 16.7 |
| 1.5 M Tris-HCl (pH8.8) | 1.3 | 2.5 | 3.8 | 5.0 | 6.3 | 7.5 | 10.0 | 12.5 |
| 10% SDS | 0.05 | 0.1 | 0.15 | 0.2 | 0.25 | 0.3 | 0.4 | 0.5 |
| 10% APS | 0.05 | 0.1 | 0.15 | 0.2 | 0.25 | 0.3 | 0.4 | 0.5 |
| TEMED | 0.002 | 0.004 | 0.006 | 0.008 | 0.01 | 0.012 | 0.016 | 0.02 |
| 12% 的胶 | ||||||||
| 水 | 1.6 | 3.3 | 4.9 | 6.6 | 8.2 | 9.9 | 13.2 | 16.5 |
| 30% 丙烯酰胺溶液（29:1） | 2.0 | 4.0 | 6.0 | 8.0 | 10.0 | 12.0 | 16.0 | 20.0 |
| 1.5 M Tris-HCl (pH8.8) | 1.3 | 2.5 | 3.8 | 5.0 | 6.3 | 7.5 | 10.0 | 12.5 |
| 10% SDS | 0.05 | 0.1 | 0.15 | 0.2 | 0.25 | 0.3 | 0.4 | 0.5 |
| 10% APS | 0.05 | 0.1 | 0.15 | 0.2 | 0.25 | 0.3 | 0.4 | 0.5 |
| TEMED | 0.002 | 0.004 | 0.006 | 0.008 | 0.01 | 0.012 | 0.016 | 0.02 |
| 15% 的胶 | ||||||||
| 水 | 1.1 | 2.3 | 3.4 | 4.6 | 5.7 | 6.9 | 9.2 | 11.5 |
| 30% 丙烯酰胺溶液（29:1） | 2.5 | 5.0 | 7.5 | 10.0 | 12.5 | 15.0 | 20.0 | 25.0 |
| 1.5 M Tris-HCl (pH8.8) | 1.3 | 2.5 | 3.8 | 5.0 | 6.3 | 7.5 | 10.0 | 12.5 |
| 10% SDS | 0.05 | 0.1 | 0.15 | 0.2 | 0.25 | 0.3 | 0.4 | 0.5 |
| 10% APS | 0.05 | 0.1 | 0.15 | 0.2 | 0.25 | 0.3 | 0.4 | 0.5 |
| TEMED | 0.002 | 0.004 | 0.006 | 0.008 | 0.01 | 0.012 | 0.016 | 0.02 |
- 将丙烯酰胺溶液倒入电泳设备玻璃板之间的间隙中，注意为积层胶留出足够的空间（梳齿长度加 1 cm）。小心加入异丙醇（或 70% 乙醇或水饱和丁醇），覆盖丙烯酰胺溶液。将凝胶室温垂直放置。
覆盖液可以防止氧气扩散进入凝胶抑制聚合，并除去表面的气泡，获得光滑平面。
预留一些丙烯酰胺溶液，用于判断聚合是否完成。
丙烯酰胺聚合完成后（约 30 min），倒掉凝胶上的覆盖液，用去离子水冲洗凝胶顶部数次以去除未聚合的丙烯酰胺。尽量排尽凝胶顶部的液体，并用滤纸边缘移走任何残留的去离子水。
参照 Table 3 配制积层胶溶液，按顺序加入相应试剂后混匀溶液。一旦加入 TEMED 后，丙烯酰胺就会开始快速聚合。因此，应立即快速混匀混合液后，进行下一步操作。
Table 3. Tris-甘氨酸 SDS-PAGE 5% 浓缩胶的制备方案
| 成分 | 1mL | 2mL | 3mL | 4mL | 5mL | 6mL | 8mL | 10mL |
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 水 | 0.68 | 1.4 | 2.1 | 2.7 | 3.4 | 4.1 | 5.5 | 6.8 |
| 30% 丙烯酰胺溶液（29:1） | 0.17 | 0.33 | 0.5 | 0.67 | 0.83 | 1.0 | 1.3 | 1.7 |
| 1.5 M Tris-HCl (pH6.8) | 0.13 | 0.25 | 0.38 | 0.5 | 0.63 | 0.75 | 1.0 | 1.25 |
| 10% SDS | 0.01 | 0.02 | 0.03 | 0.04 | 0.05 | 0.06 | 0.08 | 0.1 |
| 10% APS | 0.01 | 0.02 | 0.03 | 0.04 | 0.05 | 0.06 | 0.08 | 0.1 |
| TEMED | 0.001 | 0.002 | 0.003 | 0.004 | 0.005 | 0.006 | 0.008 | 0.01 |
向分离胶的上方加入积层胶混合液。立即将一把干净的梳子插入积层胶，小心避免引入气泡。需要时，继续添加积层胶至完全填满梳齿间的空隙，将凝胶室温垂直放置。
积层胶聚合完成后（约 30 min），小心取出梳子。立即用去离子水洗去胶孔中没有聚合的丙烯酰胺。如果需要，可用一个钝的针头注射器将积层胶中的齿孔扶正。
上样和跑胶
材料
- SDS-PAGE 凝胶（自制或购买预制胶）
- Tris-甘氨酸电泳缓冲液（25 mM Tris，192 mM 甘氨酸，0.1% SDS，pH8.3）
- 变性后的蛋白样品
- 蛋白 Markers（如 Spectra™ Multicolor Broad Range Protein Ladder）
Table 4. 10X Tris-甘氨酸电泳缓冲液（pH8.3）制备方案
| 成分 | 量 | 终浓度 |
|---|---|---|
| Tris | 29 g | 250 mM |
| 甘氨酸 | 144 g | 1920 mM |
| SDS | 10 g | 1% |
| 去离子水 | 至 1000 mL |
设备
- 垂直电泳槽
- 电泳仪电源
方法
将凝胶装入电泳设备。向电泳槽的上槽和下槽中加入 Tris-甘氨酸电泳缓冲液，如果需要，可用一个 U 形弯曲针头注射器移除凝胶底部玻璃板之间引入的气泡。
在两侧胶孔底部加入不同体积的蛋白 Marker（用于标记凝胶方向），并按预定的顺序向胶孔底部逐个加入样品，样品加样体积的多少，取决于梳子与凝胶的厚度；例如，通常使用 3.35 mm 孔宽梳齿和 1 mm 厚的凝胶，对应的样品体积为 20 µL。
推荐 10−40 µg 来自裂解的蛋白或 10−500 ng 纯化的蛋白。
在所有未使用的胶孔中加入相同体积的 1X SDS 凝胶加样缓冲液，可以减少凝胶边缘处蛋白质样品电泳迁移率的差异。
- 将电泳设备连接到电泳仪电源上（红色的阳极需与缓冲液下槽相连）。凝胶电压设定为 8 V/cm。当染料前沿进入分离胶后，将电压提高到 15 V/cm，电泳直至溴酚蓝到达分离胶的底部。小胶（长约 8 cm）通常 1 h 内可以完成；大胶则需要更长的电泳时间。
积层胶中蛋白质的迁移率慢，可以增加分辨率。许多生产厂商推荐用高于 15V/cm 的电压加速分离胶电泳；然而，发热量也会因此增大，凝胶过热会使条带扭曲，甚至会导致玻璃板碎裂。
电场中离子的移动速度与场强（每单位距离的伏特）成正比。电压越高，离子移动速度越快。在 Tris-甘氨酸电泳缓冲液体系中，凝胶中高导电的氯离子被电泳缓冲液中导电性较低的甘氨酸离子所替代，电泳槽电阻会逐渐增大。在恒流模式下，电阻增大，电压也会逐渐增大，蛋白迁移速度会越来越快，同时电泳槽也会产生更多的热。在恒定电流下运行电泳时，应在电源上按照最高电压或稍高于最高电压设置一个电压限值，以避免危险。
- 从装置中取出三明治样凝胶板，置于吸水纸上，用撬板轻轻撬开凝胶板，小心取出凝胶。
References
(美)M.R.格林(Michael R. Green) (美)J. 萨姆布鲁克(Joseph.Sambrook) 主编, 贺福初 译. 分子克隆实验指南(原书第四版)(精装上下册)[M]. 分子克隆实验指南（原书第四版）（精装上下册）, 2017.