Western Blot 实验操作 01：样品准备
细胞裂解和蛋白提取
材料
- 哺乳动物悬浮或单层生长的细胞样品或组织样品
- 裂解缓冲试剂
- 蛋白酶抑制剂 Cocktail
- 磷酸酶抑制剂 Cocktail
设备
- 高效匀浆器（匀浆组织时选用）
- 高速冷冻离心机
裂解剂的选择
根据目的蛋白的位置选择合适的裂解缓冲液，通常使用 RIPA。
| 蛋白质位置 | 推荐缓冲液 |
|---|---|
| 全细胞 | NP-40/RIPA |
| 细胞质（可溶性） | Tris-HCl |
| 细胞质（细胞骨架结合） | Tris-Triton |
| 膜结合 | NP-40/RIPA |
| 细胞核 | RIPA 或采用细胞核结构组分实验方案* |
| 线粒体 | RIPA 或采用线粒体结构组分实验方案* |
*专门或主要存在于亚细胞结构位置的蛋白质在亚细胞结构组分裂解物中的富集程度高于全细胞或组织裂解物。这对于试图获取弱表达蛋白的信号非常有用。
| 缓冲液名称 | 配方 |
|---|---|
| NP-40 缓冲液 | - 150 mM 氯化钠 - 1.0 % NP-40（可用 Triton X-100 替代 NP-40） - 50 mM Tris，pH 8.0 |
| RIPA 缓冲液 | - 150 mM 氯化钠 - 1.0 % NP-40 或 Triton X-100 - 0.5 % 脱氧胆酸钠 - 0.1 % SDS - 50 mM Tris，pH 8.0 |
| Tris-HCl 缓冲液 | - 20 mM Tris-HCl，pH 7.5 |
| Tris-Triton 缓冲液 | - 10 mM Tris，pH 7.4 - 100 mM NaCl - 1 mM EDTA - 1 mM EGTA - 1 % Triton X-100 - 10 % 甘油 - 0.1 % SDS - 0.5 % 脱氧胆酸盐 |
以上 4 种缓冲液可在 4 °C 下保存数周，分装之后可在 -20 °C 下储存长达 1 年。
NP-40 是研究细胞质蛋白、膜结合蛋白或全细胞提取物的常用一种缓冲液。
如果担心目标蛋白不能从不溶材料或聚集体中完全提取出来，那么利用 RIPA 缓冲液更适合，因为其中所含的离子去垢剂更容易使蛋白质溶解，其提取细胞核蛋白的效果比仅含 NP-40 或 Triton X-100 的缓冲液的效果更好，但会破坏蛋白质与蛋白质的相互作用，因此可能会给免疫沉淀分析和pull-down实验带来一些问题。
如需保护蛋白质与蛋白质的相互作用，或需最大限度避免蛋白质变性，应使用不含离子去垢剂（例如 SDS）的缓冲液，理想的缓冲液中还不应含有非离子去垢剂（例如 Triton X-100）。
使用不含去垢剂的缓冲液制备细胞裂解物时需进行机械剪切操作，通常利用匀浆器或使细胞通过注射器针头来完成此操作。这些情况下使用 Tris 缓冲液即可，但如前文所述，要释放膜结合蛋白或细胞骨架结合蛋白，必须使用含有去垢剂的缓冲液。
方法
细胞裂解会破坏细胞膜和细胞器，导致蛋白酶和磷酸酶活性不受调控，从而影响蛋白质的收率和功能。为了防止提取的蛋白降解，需要在细胞裂解试剂中添加蛋白酶和磷酸酶抑制剂。
贴壁细胞
将细胞培养皿放置冰上并用冰冷的 PBS 洗涤细胞。
去除 PBS，每 107 细胞或 100 mm 培养皿加入 1 mL 冰冷的裂解缓冲液。
用预冷的塑料细胞刮刀将贴壁细胞从培养皿上刮下，然后轻轻将细胞悬液转移到预冷的小离心管中。
或用胰蛋白酶消化细胞并用 PBS 洗涤细胞，然后将细胞重悬浮于小离心管内的裂解缓冲液中。
4 °C 下持续振摇 30 分钟。
4 °C 下 16 000 g 离心 20 min。
轻轻地从离心机中取出离心管放置在冰上。将上清液吸出转移到放置在冰上预冷的新管中，弃去沉淀。
悬浮细胞
4 °C 下 200–1900 g 离心 5–10 min 收集细胞。
去除培养基，用冰冷的 PBS 重悬细胞。200–1900 g 离心 5–10 min 沉淀细胞。
去除 PBS，每 107 细胞加入 1 mL 冰冷的裂解缓冲液。
4 °C 下持续振摇 30 分钟。
4 °C 下 16 000 g 离心 20 min。
轻轻地从离心机中取出离心管放置在冰上。将上清液吸出转移到放置在冰上预冷的新管中，弃去沉淀。
组织
在冰上用干净器械解剖目标组织，并且越快越好以防蛋白酶降解。
将组织放入圆底离心管中，浸入液氮中“速冻”。
每 5 mg 的组织，向管中迅速加入 300 μL 裂解液，并用电动匀浆器匀浆，匀浆过程中，继续添加 300–600 μL 裂解液并冲洗刀头。
4 °C 下持续振摇 2 h。
4 °C 下 16 000 g 离心 20 min。
轻轻地从离心机中取出离心管放置在冰上。将上清液吸出转移到放置在冰上预冷的新管中，弃去沉淀。
出现粘度样品通常是由于含有大量 DNA，可以超声 10–15 s，3 次，或加入 DNase，以剪切 DNA 降低粘度。
References
蛋白定量及变性
材料
- 包含蛋白的细胞裂解液样品
- BCA 蛋白检测试剂盒
- 白蛋白（BSA）标准品
- 96 微孔板
- 裂解缓冲液（同细胞裂解）
- SDS-PAGE 蛋白上样缓冲液（5X，含 DTT）
SDS 可与蛋白质结合使蛋白质-SDS 复合物上带有大量的负电荷，这时蛋白质本身的电荷完全 SDS 掩盖，消除了各种蛋 白质本身电荷的差异，SDS 还可以断开分子内和分子间的氢键，破坏蛋白质分子的二级和三级结构，DTT 可以断开半胱氨酸残基之间的二硫键，破坏蛋白质的空间结构，消除了蛋白结构之间的差异。因此，电泳速度只是与其分子量大小有关。溴酚蓝用作电泳时的指示剂，可大概指示电泳结束的时间。
设备
- 微孔板振荡器
- 酶标仪
- 恒温金属浴
方法
如果你的蛋白抽提试剂中含有大量去垢剂且不含有螯合剂、还原剂时， 可使用 BCA 法；如果你的蛋白里含有 EDTA 等金属螯合剂或者含有还原型物质，且不含有去垢剂时，可使用 Bradford 法。对于使用 RIPA 试剂提取的蛋白（含有大量去垢剂），通常采用商业化的 BCA 试剂盒进行检测。
BCA 法蛋白定量
以 Pierce™ BCA 蛋白检测试剂盒 为例，若更换其他试剂盒，应参考相关说明调整试验。
制备稀释的白蛋白（BSA）标准品。或者：使用预稀释的 BSA 标准品。
将 BCA 试剂 A 和试剂 B 按 50 : 1 混合，制备 BCA 工作液体。
用移液管吸取 25 µL 标准品或未知样品复本，加入微孔板孔（工作范围：20–2000 µg/mL）。
取少量样品使用裂解缓冲液稀释 5–10 倍，工作范围。
向每个孔中加入 200 µL 工作试剂，并在微孔板振荡器上充分混合 30 秒。
盖上微孔板，在 37 °C 下孵育 30 min。
将微孔板冷却至室温。在酶标仪上测量 562 nm 处或附近的吸光度。
根据标准曲线计算样品蛋白浓度。
蛋白变性
吸取适宜样品用裂解缓冲液将蛋白稀释到相同浓度。
再吸取上述样品加入上样缓冲液（Loading buffer）稀释，蛋白终浓度建议为 1–5 mg/mL。
或参考下表直接稀释：
| 顺序 | 试剂 | 使用量（μL） | 终浓度 |
|---|---|---|---|
| 1 | Total protein | \(V\) | \(c_2\) |
| 2 | Lysis buffer | \(80-V\) | |
| 3 | 5X Loading buffer | \(20\) | 1X |
| 总体积 | \(100\) |
\[ V = \frac{100c_2}{c_1} \]
- \(100\)：指稀释后的蛋白样品总体积为 100 μL；
- \(c_2\)：稀释后样品总蛋白浓度，mg/mL，建议为 1–5 mg/mL；
- \(c_1\)：样品稀释前总蛋白浓度，mg/mL。
- \(V\)：总蛋白样品使用体积，μL；
- 70 °C 加热 10 min 以变性蛋白。
在含 SDS 的缓冲液中于 100 °C 下加热样品可能导致蛋白质水解 (Kurien BJ and Scofield RH, 2012)。因此，建议在 70 °C 下加热用于变性电泳（还原或非还原状态）的样品 2–10 min，以获得理想的结果。
- 样品冷却后用于下一步实验。
样品分装后避免反复冻融， -20 °C 至少可以保存 3 个月，如果需长期保存，请储存在 -80 °C。
References
Kurien B T , Scofield R H .Common Artifacts and Mistakes Made in Electrophoresis[J].Methods in molecular biology (Clifton, N.J.), 2012, 869:633-640.DOI:10.1007/978-1-61779-821-4_58.