RT-qPCR 实验操作（全）

发表于 Waline：

总 RNA 提取

材料

  • 悬浮或单层生长的细胞样品或组织样品
  • 氯仿或1-溴-3-氯丙烷（氯仿，品牌：Greagent，型号/货号：G75915B）

溴氯丙烷是一种可取的氯仿替代物，因为它毒性更小且不易挥发。此外，溴氯丙烷可以提供更好的液相分离，从而更好地从总 RNA 中去除基因组 DNA，获得更纯的 RNA。

  • 异丙醇（异丙醇，品牌：Greagent，型号/货号：G75885B）
  • 糖原（20 mg/mL 储存液）（可选）
  • 无 RNase 的水（DEPC 水，品牌：Beyotime，型号/货号：R0022）
  • 乙醇（无水乙醇，品牌：Greagent，型号/货号：G73537AC）
  • 75% 乙醇（用无水乙醇和 DEPC 水配制）
  • 单相裂解试剂（如 TRIzol）（TriQuick Reagent 总 RNA 提取试剂，品牌：Solarbio，型号/货号：R1100）
  • 磷酸盐缓冲液（PBS）（1X）（PBS 缓冲液，品牌：Solarbio，型号/货号：P1020）

设备

  • Glass-Teflon 或高效匀浆器（如 Polytron，或 Tekmar's TISSUMIZER 或类似设备）（匀浆组织时选用）
  • 高速冷冻离心机（ 离心机，品牌：Thermo Scientific，型号/货号：Legend Micro 17R）

方法

除另有说明外，该过程在室温下（15–30 °C）进行，并且试剂是在 15–30 °C 放置。

样品匀浆

样品的体积应不超过用于匀浆的单相裂解试剂体积的 10%。

  1. 准备并匀浆单层细胞，悬浮培养物或组织样本。

贴壁生长的单层细胞

  • 移除培养基，并用 1–2 mL 冰冷的 PBS 漂洗细胞一次。
  • 移除 PBS，直接在培养皿中裂解细胞，每 10 cm2 培养皿加入 1 mL 的单相裂解试剂并用细胞刮刀刮取。

单相裂解试剂的添加量基于培养皿的面积而不是细胞数量（10 cm2/mL）。单相裂解试剂不足可能导致提取的 RNA 有 DNA 污染。

  • 用吸头吹打几次细胞裂解液，彻底混悬。
  • 继续进行步骤 2。

样品可以储存在 -60–-70 °C 至少 1 个月。

悬浮生长的细胞

  • 200–1900 g 室温在台式离心机中离心 5–10 min 收集细胞（1000–3000 r/min 在 Sorvall H1000 转子中）。
  • 去除培养基，用冰冷的 PBS 重悬细胞。200–1900 g 离心 5 min 沉淀细胞。
  • 每 5×106–10×106 个细胞，加入 1 mL 的单相裂解试剂，重复吸打或通过注射器和针头抽吸裂解细胞。
  • 继续进行步骤 2。

样品可以储存在 -60–-70 °C 下至少 1 个月。

组织

  • 每 50–100 mg 组织用 1 mL 的单相裂解试剂匀浆组织样本，使用 glass–Teflon 或高效匀浆器匀浆。

对于蛋白质、脂肪、糖类或细胞外物质含量高的样品，如肌肉和脂肪组织，可以执行下述可选步骤；否则，请继续步骤 2。

样品可以储存在 -60–-70 °C 至少 1 个月。

  • 匀浆后样品于 2–8 °C，12 000 g 离心 10 min，从组织匀浆液除去不溶物。

沉淀里包含细胞外膜、多糖类和高分子质量的 DNA，而上清液中包含 RNA。

  • 从脂肪组织样本中去除脂肪收集顶层。
  • 将澄清的匀浆溶液转移到新的管中。
  • 请继续进行步骤 2。

样品可以储存在 -60–-70 °C 至少 1 个月。

相分离

  1. 孵育匀浆样品，室温 5 min，以完全解离核蛋白复合物。

  2. 每毫升初始匀化单相裂解试剂匀化样品加入 0.2 mL 氯仿。盖紧管盖，用力摇动试管 15 s，并在室温下孵育 2–3 min。

不要涡旋样品，因为它会导致 DNA 污染。

  1. 2–8 °C，12 000 g 离心 15 min。混合物分为下层酚-氯仿相、中间相和上层水相。RNA 仅存在于上层水相。

在这个方案，此步骤和步骤 7 中如果将离心时间增加到 30–60 min，也可使用最大速度 2600 g 的台式离心机。

  1. 小心地将上层水相转移到新的离心管中，注意不要扰动中间层。每毫升初始匀化单相裂解试剂可获得约 600 μL 水相。

如果需要分离 DNA 或蛋白质，请保留有机相。

水相的体积应该为在步骤 1 中使用的单相裂解试剂体积的 60%。虽然每毫升单相裂解试剂可以获取 600 μL 水相，为了防止 DNA 的污染，推荐只收回 500 μL。

分离 RNA

  1. 从水相中沉淀 RNA，每毫升初始单相裂解试剂加入 0.5 mL 的异丙醇。颠倒离心管几次混匀。在室温下孵育样品 10 min。

加入 1 μL 糖原（20 mg/mL）储存液使步骤 7 中形成的沉淀可见。

  1. 于 2–8 °C，不超过 12 000 g 离心 10 min，收集 RNA 沉淀。

离心管在离心机中按同一个朝向向心放置，便于观察 RNA 沉淀位置。

RNA 沉淀在离心之前通常是不可见的，离心后在试管底部的一侧形成凝胶样沉淀。

  1. 弃去上清液，并用吸头完全去除残留液体。

  2. 用 75% 乙醇洗涤一次 RNA 沉淀，加入至少 1 mL 75% 乙醇，涡旋混合样品液，然后在 2–8 °C 以不超过 7500 g 离心 5 min。

离心管在离心机中按同一个朝向向心放置，便于观察 RNA 沉淀位置。

在 75% 乙醇中的 RNA 沉淀存储在 2–8 °C 至少 1 周，或在 -5–-20 °C 存储至少 1 年。

  1. 完全去除乙醇，空气干燥或真空干燥 RNA 沉淀 5–10 min。

除去乙醇后，沉淀应该是半透明的，在干燥时，沉淀将变成透明凝胶体状。不要真空离心干燥 RNA。重要的是不要让 RNA 沉淀完全干燥，因为这将大大降低其溶解度。部分溶解的 RNA 样品 A260/A280 比值为 1.6。

  1. 用 20 μL 的无 RNase 水溶解 RNA，吸头反复吸打几次，然后在 55–60 °C 温育该溶液 10 min。

为了更好地溶解 RNA，可以使用加热到 40 °C 的无 RNase 水。RNA 也可溶于 100% 甲酰胺（去离子），可在 -20 °C 下储存 1 年。甲酰胺提供了一种稳定的化学环境，保护 RNA 不被 RNase 降解。

附 1：不同样品总 RNA 终浓度范围

按上述方法，不同样品获得的总 RNA 终浓度大致范围如下：

每 mL 单相裂解液样品量 总 RNA 含量** 总 RNA 终浓度***
贴壁生长的单层细胞 1.2 x 106 Cells* 5–10 μg/106 300–600 ng/μL
悬浮生长的细胞 5×106–10×106 Cells 5–10 μg/106 1250–5000 ng/μL
组织 50–100 mg 4–7 μg/mg 10000–35000 ng/μL

*按 35 mm 培养皿或 6 孔培养板汇合时的细胞数为 1.2 x 106 个。

**总 RNA 的产率因组织或细胞来源而异，但一般而言，组织总 RNA 的初始产量为 4–7 μg/mg 初始组织或 5–10 μg/106 细胞。

***RNA 终浓度，按 20 μL 无 RNase 水溶解 75% 乙醇沉淀后的 RNA 计算。

RNA 定量

材料

  • 适当稀释的总 RNA 样品
  • 空白检测溶液（TE（pH 8.0）、无 RNase 的水等）（DEPC 水，品牌：Beyotime，型号/货号：R0022）
  • 无尘纸（镜头清洁擦拭纸，品牌：ORDER，型号/货号：OD-0131）

设备

  • 微量分光光度计（微量 UV-Vis 分光光度计，品牌：Thermo Scientific，型号/货号：NanoDrop One）

方法

通常使用微量分光光度计（如 NanoDrop One）对总 RNA 进行质量控制和定量，不同厂家设备具体操作可能略有不同，大致操作流程如下：

  1. 根据样品选择正确的检测项目，如 双链 DNA、单链 DNA 或 RNA 等；

  2. 无尘纸擦拭上下基座，取 1–2 μL 空白检测溶液至基座，降下检测臂，进行基线校正；

  3. 无尘纸擦拭上下基座，取 1–2 μL 均匀样品至基座，降下检测臂，进行检测；

  4. 读取检测样品在 260 nm、280 nm 和 230 nm 处的吸收值，OD260/OD280、OD260/OD230 应符合下表要求：

Table 1. 核酸理想吸光度比值范围

DNA RNA
OD260/OD280 ~1.8 (1.7–1.9)* ~2.0 (1.7–2.0)*
OD260/OD230 >2.0* >2.0*

*不同文献中可接受范围略有差异，此处参考《GB/T 37874-2019 核酸提取纯化方法评价通则》。此外，OD260/OD280 比值依赖于 pH 和离子强度。随着 pH 的增加，OD280 降低，但 OD260 不受影响，从而 OD260/OD280 的比值增加。因为纯水（如蒸馏水、MilliQ 或无 RNase/DNase 水）pH 为酸性，如果使用它们溶解 RNA，OD260/OD280 的比值可能偏低。因此，为了准确的可重复的读数，最好使用缓冲液如 TE（pH 8.0）作为稀释剂和空白对照。

并按下列公式计算 RNA 浓度：

\[ RNA\ 样品浓度\ (ng/μL) = OD260 × 40 × 稀释倍数 \]

RNA 浓度应在微量分光光度计检测范围内，否则样品溶液应进行适当稀释或浓缩。以 NanoDrop One 为例，260 nm 处（核酸）或 280 nm 处（蛋白质）的最大吸光度应小于 62.5 A。

反转录

材料

  • 已测定浓度的总 RNA 样品
  • PrimeScript™ RT Master Mix (Perfect Real Time)（品牌：TaKaRa，型号/货号：RR036A）

It contains a 5X pre-mixed reagent containing all of the components needed for quantitative RT-PCR reverse transcription (PrimeScript RTase, RNase Inhibitor, Random 6 mers, Oligo dT Primer, dNTP Mixture, and reaction buffer), and a reaction can be started simply by adding template RNA and water.

  • RNase Free dH2O（PrimeScript™ RT Master Mix 内置）
  • 微量离心管（0.2 mL）（PCR 单管，品牌：A-gen，型号/货号：PCR-02）

设备

  • 盛有冰的容器
  • 涡旋混匀仪（基本型涡旋振荡器，品牌：Thermo Scientific，型号/货号：88882012）
  • 掌上型迷你离心机（掌上型迷你离心机，品牌：Kylin-Bell，型号/货号：LX-500）
  • 可编程所需扩增程序的热循环仪（MiniAmp Plus PCR 热循环仪，品牌：Thermo Scientific，型号/货号：C37835）

方法

此方法仅适用于 PrimeScript™ RT Master Mix (Perfect Real Time)，若更换其他试剂，建议参考相关资料适当调整试验。

  1. 将微量离心管放置在冰上，按下列组分配制 RT 反应液：
试剂 使用量（μL） 终浓度
5X PrimeScript RT Master Mix（Perfect Real Time） 4 1X
Total RNA V
RNase Free dH2O 16 - V
总体积 20

其中：

\[ V = \frac{1000}{c} \]

  • V：Total RNA 使用量，μL；
  • c：Total RNA 浓度，ng/μL；
  • 1000：指 20 μL 反应体系可最大使用 1000 ng 的 Total RNA。
  1. 轻柔混匀，掌上型迷你离心机聚集反应液后，进行反转录反应，热循环仪条件如下：
温度 时间 备注
37 °C 15 min 反转录反应
85 °C 5 s 反转录酶的失活反应
4 °C

反转录产物为单链 cDNA，-20 °C 保存，减少反复冻融次数，可以使用一年以上。

Real Time PCR

材料

  • cDNA
  • 各 Forward Primer 和 Reverse Primer（包括目的基因和至少一个内参基因）
  • Hieff® qPCR SYBR Green Master Mix (No Rox)（品牌：Hieff，型号/货号：11201ES08）

Hieff® qPCR SYBR Green Master Mix (No Rox) 是 2X 实时定量 PCR 扩增的预混合溶液。Mix 中含有热启动 Hieff® DNA Polymerase、SYBR Green I、dNTPs、Mg2+。使用时，仅需在扩增体系中加入模板和引物即可进行实时荧光定量 PCR，大大简化操作过程，降低污染几率。

  • 荧光定量 PCR 板（384 孔荧光定量 PCR 板，品牌：Monad，型号/货号：MQ50601S）

  • PCR 封板膜（高透光压感 qPCR 封板膜，品牌：Monad，型号/货号：MQ50601M） ## 设备

  • 盛有冰的容器

  • 掌上型迷你离心机（掌上型迷你离心机，品牌：Kylin-Bell，型号/货号：LX-500）

  • 微孔板离心机（品牌：YEASEN，型号/货号：ES-PC25）

  • 实时荧光定量 PCR 仪（CFX Opus 384 Real-Time PCR System，品牌：Bio-Rad，型号/货号：12011452）

方法

此方法仅适用于 Hieff® qPCR SYBR Green Master Mix (No Rox)，若更换其他试剂，建议参考相关资料适当调整试验。

  1. 在 PCR 板上划分出标记（下图中蓝线），方便加样；

尽管没有证据证明油墨在高温下挥发，长期可能损坏实时荧光定量 PCR 仪；但仍建议标记不要超过 PCR 封板膜区域。

  1. 将离心管放置在冰上，按下列组分预混 Hieff® qPCR SYBR Green Master Mix、Forward Primer 和 Reverse Primer，充分混匀，掌上型迷你离心机聚集后备用；
组分 用量（μL） 终浓度
Hieff® qPCR SYBR Green Master Mix (No Rox) \(10n\)* 1X
Forward Primer (10 μM) \(0.4n\)* 0.2 μM
Reverse Primer (10 μM) \(0.4n\)* 0.2 μM

*\(n\) 按 1.1–1.15 倍实际孔数计算，并向上取整；如上图中每个基因有 48 孔，则 \(n=[48×1.1]=53\)。

  1. 模板稀释：将 cDNA 放置在冰上，按相同比例使用无菌超纯水稀释各 cDNA 原液，建议 5–10 倍稀释，最佳模板加入量以扩增得到的 Ct 值在 20–30 个循环为宜；

  2. 将 PCR 板放置在冰上，每孔按下列组分配制 PCR 反应液：

组分 用量（μL）
Hieff® qPCR SYBR Green Master Mix (No Rox) + Primer 预混液 10.8
稀释后的 cDNA 9.2

相当于

组分 用量（μL） 终浓度
Hieff® qPCR SYBR Green Master Mix (No Rox) 10 1X
Forward Primer (10 μM) 0.4 0.2 μM
Reverse Primer (10 μM) 0.4 0.2 μM
cDNA V -
无菌超纯水 to 20 -
总体积 20 -
  • 引物浓度：通常引物终浓度为 0.2 μM，也可以根据情况在 0.1–1.0 μM 之间进行调整。
  • 模板浓度：如模板类型为未稀释 cDNA 原液，使用体积不应超过 qPCR 反应总体积的 1/10。
  • 模板稀释：cDNA 原液建议 5–10 倍稀释，最佳模板加入量以扩增得到的 Ct 值在 20–30 个循环为好。
  • 建议在 20 μL 反应液中使用相当于 10 pg–100 ng Total RNA 量的 cDNA 为模板。

  1. 轻磕 PCR 板，使液体尽可能聚于孔底，小心使用 PCR 封板膜封板；

  2. 充分混匀后（避免剧烈震荡产生过多气泡），使用微孔板离心机聚集反应液，在实时荧光定量 PCR 仪上按下列条件扩增：

步骤 温度 时间 循环数
预变性 95 °C 3 min 1
变性 95 °C 10 s 40*
退火/延伸 60 °C 30 s 40*
熔解曲线阶段 仪器默认设置 仪器默认设置 1

*95 °C 变性 10 s 后 60 °C 退火/延伸 30 s 为一个循环，共循环 40 次。

少量气泡在预变性高温阶段破裂，因此并不影响检测。

结果分析

数据要求

  1. 反应结束后需要确认扩增曲线及熔解曲线，标准扩增曲线为 S 型，熔解曲线呈单峰；

  2. Ct 值介于 20–30 之间时，定量分析最准确；Ct 值小于 10 时，需要将稀释模板后，重新进行实验；Ct 值介于 30–35 之间时，需要提高模板浓度，或者增大反应体系的体积，以提高扩增效率，保证结果分析的准确性；Ct 值大于 35 时，检测结果无法定量分析基因的表达量，但可用于定性分析。

  3. 定量实验至少需要三个生物学重复；所有复孔间的差别应该在 0.5 Ct 内；在 35 个循环以后，Ct 值变化较大，定量结果可能不太可靠。

标准扩增曲线为 S 型，如下图：

PCR 前期，目的 DNA 以指数形式扩增，这一扩增时期称为指数期（Exponential phase）；PCR 后期，由于引物和 dNTP 等反应底物的减少，目的 DNA 片段扩增的速度变慢，直至停止，这一扩增时期称为平台期（Plateau phase）。qPCR 过程中，荧光值随着目的 DNA 的扩增而增加，当荧光值达到阈值时的循环数称为 Ct 值，Ct 值越小，说明目的 DNA 的初始浓度越大。

熔解曲线是 SYBR Green 法 qPCR 实验中评价扩增特异性的关键指标，只有熔解曲线呈单峰，才能说明 qPCR 是特异扩增。一般产物的熔解温度 Tm 值（熔解曲线的峰）在 75–90 °C，如果在较低温度有一个小峰，可能是引物二聚体；如果 Tm 值在 90 °C 以上，说明目的片段 GC 含量过高，或者扩增长度过长。另外，如果 cDNA 样本中有 gDNA 残余，且 gDNA 也发生扩增时，也会造成双峰。可以将 qPCR 产物进行凝胶电泳，和熔解曲线的结果相互印证。一般熔解曲线中有几个峰，电泳中泳道里就有几条带。

2-ΔΔCt 法计算目的基因相对表达量

假设计算目的基因（Target）在给药组（Treatment）中相对于模型组（Control）的表达量，其中内参基因（References）在总 RNA 中表达稳定。计算公式如下：

\[ \Delta Ct = Ct_{Target} - Ct_{Reference} \]

\[ \Delta\Delta Ct = \Delta Ct_{Treatment} - \Delta Ct_{Control} \]

\[ Relative\ Expression = 2^{-\Delta\Delta Ct} \]

内参基因（Reference gene），又称看家基因，这类基因在不同的样本中表达量比较稳定，如 β-actin、tubilin、16s rRNA、GAPDH 等。在相对定量中，内参基因可以校准不同样本间总 RNA 量的差异。

考虑到实际实验中，每组至少有三个生物学重复，因此各样品

\[ \Delta Ct = Ct_{Target} - Ct_{Reference} \]

，并计算各样品

\[ 2^{-\Delta Ct} \]

，其中

\[ \overline{2^{-\Delta Ct}_{Control}}=\frac{\sum{2^{-\Delta Ct}_{Control}}}{n} \]

，因此

\[ Relative\ Expression = 2^{-\Delta\Delta Ct}=\frac{2^{-\Delta Ct}}{\overline{2^{-\Delta Ct}_{Control}}} \]

，并对各样品的 RNA 相对表达量进行统计学比较。

References

  1. (美)M.R.格林(Michael R. Green) (美)J. 萨姆布鲁克(Joseph.Sambrook) 主编, 贺福初 译. 分子克隆实验指南(原书第四版)(精装上下册)[M]. 分子克隆实验指南（原书第四版）（精装上下册）, 2017.

  2. 细胞培养皿、培养板和培养瓶-赛默飞 | Thermo Fisher Scientific - CN

  3. 准备一份好的核酸模板，真的非常有必要 (yeasen.com)

  4. When It’s All About Quality: The Importance of Purity and Integrity Estimation (bioecho.com)

  5. GB/T 37874-2019,核酸提取纯化方法评价通则[S].

  6. PrimeScript™ RT Master Mix (Perfect Real Time) Product Manual

  7. Hieff® qPCR SYBR Green Master Mix (No Rox) 产品说明书

  8. 基因表达研究⸺qPCR实验指南