高效液相色谱方法的建立 02：驻留时间和死时间

发表于 Waline：

液相系统流路

我们先来理解一下液相系统流路：

\[ \text{泵/混合器} \xrightarrow{t_A} \text{进样器} \xrightarrow{t_B} \text{色谱柱} \xrightarrow{t_C} \text{检测器} \]

  • \(t_A\)：从泵的混合器到进样器所需的时间；
  • \(t_{\text{inj}}\)：进样器所贡献的时间；
  • \(t_B\)：从进样器到色谱柱所需的时间；
  • \(t_{0,c}\)：流动相通过色谱柱内部所有空隙所花费的时间，也称柱内死时间；
  • \(t_C\)：从色谱柱到检测器所需的时间；
  • \(t_{\text{det}}\)：检测器所贡献的时间。

在色谱图上，\(t = 0\) min 是指样品从进样器注入到流路的瞬间。

驻留时间、驻留体积

在进行梯度洗脱时，由于从“泵/混合器”到“色谱柱”有一段距离，因此色谱图上 \(t_x\) 对应的浓度与梯度程序的浓度并不一致。

从下图中可以看到实际的梯度会相对设置的梯度向后平移，这段平移的时间就是驻留时间（Dwell time，\(t_D\)） 。但对于等度洗脱来说，驻留时间通常没有影响。

在液相流路中驻留时间

\[ t_D = t_A + t_B \]

驻留体积

\[ V_D = F \cdot t_D \]

驻留时间的测定

  1. 配制溶剂 A：100% 水；
  2. 配制溶剂 B：99% 乙腈，含 1% 丙酮作为示踪物；
  3. 用溶剂 A 和 B 冲洗系统；
  4. 将检测波长设置为 265 nm；
  5. 用低死体积限流器替代色谱柱（保持反压为 50 bar）；
  6. 在 0–10 分钟内运行线性梯度，使用 5%–95% B，流速 1 mL/min；
  7. 测定组成为 50% 的梯度下程序设定的洗脱时间与实际洗脱时间之间的时间差。

\[ t_D = t_{50\%} - \frac{t_{G}}{2} \]

  • \(t_{50\%}\)：在色谱图上，响应为 50% 的具体时间；
  • \(t_{G}\)：整个梯度时间，此例中 \(t_G = 10\) min。

死时间、死体积

死时间（dead time, \(t_0\)​） ：不被固定相保留的组分从进样到其在柱后出现浓度极大时的时间间隔，称为死时间。

在液相流路中死时间

\[ t_0 = t_B + t_{0,c} + t_C + t_{\text{inj}} + t_{\text{det}} \]

死时间的估算

  1. 第一个显著的基线波动；

  2. 用极强的溶剂作为流动相，如 100% 乙腈，几乎所有分析物都会立即被洗脱而没有任何保留，此时出峰的时间即近似为死时间。

  3. 通过柱尺寸计算：

色谱柱死体积

\[ V_m=\pi\times(\frac{d_c}{2})^2\times L \times \epsilon \]

  • \(d_c\) 是柱内径
  • \(L\) 是柱长
  • \(ϵ\) 是柱床的孔隙率（porosity），\(ϵ\approx 0.6\)

\[ t_0 = \frac{V_m}{F} \]

死时间的准确测定

以甲醇为流动相，测定尿嘧啶在色谱柱上的保留时间。然后用一个二通管替换色谱柱，测定尿嘧啶在通过进样阀到检测器之间管路所经历的时间（\(t_{tub}\)）：

\[ t_0 = t_{total} - t_{tub} \]

计算梯度洗脱中特定时间点的具体浓度

\[ \%B \approx \phi_{0} + \frac{t_{x} - t_0 - t_{D}}{t_G} \cdot \Delta\phi \]

  • \(\phi_{0}\)：梯度洗脱的初始浓度；
  • \(t_{x}\)：特定时间点；
  • \(t_0\)：死时间；
  • \(t_D\)：驻留时间；
  • \(\Delta\phi\)：%B 梯度变化范围，如乙腈从 5% 线性升到 95%，\(\Delta\phi = 90\%\)。

References

  1. 斯奈德.实用高效液相色谱法的建立（第二版）[M].华文出版社,2001.

  2. Lloyd R. Snyder, Joseph J. Kirkland, John W. Dolan. 现代液相色谱技术导论[M]. 人民卫生出版社, 2012.

  3. HPLC Method Development- From Beginner to Expert, Part 1：https://www.agilent.com/cs/library/slidepresentation/public/method-development-101-from-beginner-to-expert-part-1-feb202024.pdf

  4. 液相色谱手册：https://www.agilent.com/cs/library/primers/public/5990-7595CHCN.pdf

  5. 制备型液相色谱原理与实践：https://www.agilent.com/cs/library/primers/public/primer-preparative-liquid-chromatography-5994-1016zh-cn-agilent.pdf

  6. 孙小丽,郝卫强,王俊德,等.梯度液相色谱保留时间公式在梯形梯度洗脱研究中的应用[J].色谱,2013,31(08):753-757.