RT-qPCR 实验操作（四）：结果分析
数据要求
反应结束后需要确认扩增曲线及熔解曲线，标准扩增曲线为 S 型，熔解曲线呈单峰；
Ct 值介于 20–30 之间时，定量分析最准确；Ct 值小于 10 时，需要将稀释模板后，重新进行实验；Ct 值介于 30–35 之间时，需要提高模板浓度，或者增大反应体系的体积，以提高扩增效率，保证结果分析的准确性；Ct 值大于 35 时，检测结果无法定量分析基因的表达量，但可用于定性分析。
定量实验至少需要三个生物学重复；所有复孔间的差别应该在 0.5 Ct 内；在 35 个循环以后，Ct 值变化较大，定量结果可能不太可靠。
标准扩增曲线为 S 型，如下图：
PCR 前期，目的 DNA 以指数形式扩增，这一扩增时期称为指数期（Exponential phase）；PCR 后期，由于引物和 dNTP 等反应底物的减少，目的 DNA 片段扩增的速度变慢，直至停止，这一扩增时期称为平台期（Plateau phase）。qPCR 过程中，荧光值随着目的 DNA 的扩增而增加，当荧光值达到阈值时的循环数称为 Ct 值，Ct 值越小，说明目的 DNA 的初始浓度越大。
熔解曲线是 SYBR Green 法 qPCR 实验中评价扩增特异性的关键指标，只有熔解曲线呈单峰，才能说明 qPCR 是特异扩增。一般产物的熔解温度 Tm 值（熔解曲线的峰）在 75–90 °C，如果在较低温度有一个小峰，可能是引物二聚体；如果 Tm 值在 90 °C 以上，说明目的片段 GC 含量过高，或者扩增长度过长。另外，如果 cDNA 样本中有 gDNA 残余，且 gDNA 也发生扩增时，也会造成双峰。可以将 qPCR 产物进行凝胶电泳，和熔解曲线的结果相互印证。一般熔解曲线中有几个峰，电泳中泳道里就有几条带。
2-ΔΔCt 法计算目的基因相对表达量
假设计算目的基因（Target）在给药组（Treatment）中相对于模型组（Control）的表达量，其中内参基因（References）在总 RNA 中表达稳定。计算公式如下：
\[ \Delta Ct = Ct_{Target} - Ct_{Reference} \]
\[ \Delta\Delta Ct = \Delta Ct_{Treatment} - \Delta Ct_{Control} \]
\[ Relative\ Expression = 2^{-\Delta\Delta Ct} \]
内参基因（Reference gene），又称看家基因，这类基因在不同的样本中表达量比较稳定，如 β-actin、tubilin、16s rRNA、GAPDH 等。在相对定量中，内参基因可以校准不同样本间总 RNA 量的差异。
考虑到实际实验中，每组至少有三个生物学重复，因此各样品
\[ \Delta Ct = Ct_{Target} - Ct_{Reference} \] ，并计算各样品
\[ 2^{-\Delta Ct} \]
，其中
\[ \overline{2^{-\Delta Ct}_{Control}}=\frac{\sum{2^{-\Delta Ct}_{Control}}}{n} \]
，因此
\[ Relative\ Expression = 2^{-\Delta\Delta Ct}=\frac{2^{-\Delta Ct}}{\overline{2^{-\Delta Ct}_{Control}}} \]
，并对各样品的 RNA 相对表达量进行统计学比较。