RT-qPCR 实验操作（三）：两步法 RT-qPCR

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反转录

材料

  • 已测定浓度的总 RNA 样品
  • PrimeScript™ RT Master Mix (Perfect Real Time)（品牌：TaKaRa，型号/货号：RR036A）

It contains a 5X pre-mixed reagent containing all of the components needed for quantitative RT-PCR reverse transcription (PrimeScript RTase, RNase Inhibitor, Random 6 mers, Oligo dT Primer, dNTP Mixture, and reaction buffer), and a reaction can be started simply by adding template RNA and water.

  • RNase Free dH2O（PrimeScript™ RT Master Mix 内置）
  • 微量离心管（0.2 mL）（PCR 单管，品牌：A-gen，型号/货号：PCR-02）

设备

  • 盛有冰的容器
  • 涡旋混匀仪（基本型涡旋振荡器，品牌：Thermo Scientific，型号/货号：88882012）
  • 掌上型迷你离心机（掌上型迷你离心机，品牌：Kylin-Bell，型号/货号：LX-500）
  • 可编程所需扩增程序的热循环仪（MiniAmp Plus PCR 热循环仪，品牌：Thermo Scientific，型号/货号：C37835）

方法

此方法仅适用于 PrimeScript™ RT Master Mix (Perfect Real Time)，若更换其他试剂，建议参考相关资料适当调整试验。

  1. 将微量离心管放置在冰上，按下列组分配制 RT 反应液：
试剂 使用量（μL） 终浓度
5X PrimeScript RT Master Mix（Perfect Real Time） 4 1X
Total RNA V
RNase Free dH2O 16 - V
总体积 20

其中：

\[ V = \frac{1000}{c} \]

  • V：Total RNA 使用量，μL；
  • c：Total RNA 浓度，ng/μL；
  • 1000：指 20 μL 反应体系可最大使用 1000 ng 的 Total RNA。
  1. 轻柔混匀，掌上型迷你离心机聚集反应液后，进行反转录反应，热循环仪条件如下：
温度 时间 备注
37 °C 15 min 反转录反应
85 °C 5 s 反转录酶的失活反应
4 °C

反转录产物为单链 cDNA，-20 °C 保存，减少反复冻融次数，可以使用一年以上。

Real Time PCR

材料

  • cDNA
  • 各 Forward Primer 和 Reverse Primer（包括目的基因和至少一个内参基因）
  • Hieff® qPCR SYBR Green Master Mix (No Rox)（品牌：Hieff，型号/货号：11201ES08）

Hieff® qPCR SYBR Green Master Mix (No Rox) 是 2X 实时定量 PCR 扩增的预混合溶液。Mix 中含有热启动 Hieff® DNA Polymerase、SYBR Green I、dNTPs、Mg2+。使用时，仅需在扩增体系中加入模板和引物即可进行实时荧光定量 PCR，大大简化操作过程，降低污染几率。

  • 荧光定量 PCR 板（384 孔荧光定量 PCR 板，品牌：Monad，型号/货号：MQ50601S）

  • PCR 封板膜（高透光压感 qPCR 封板膜，品牌：Monad，型号/货号：MQ50601M） ## 设备

  • 盛有冰的容器

  • 掌上型迷你离心机（掌上型迷你离心机，品牌：Kylin-Bell，型号/货号：LX-500）

  • 微孔板离心机（品牌：YEASEN，型号/货号：ES-PC25）

  • 实时荧光定量 PCR 仪（CFX Opus 384 Real-Time PCR System，品牌：Bio-Rad，型号/货号：12011452）

方法

此方法仅适用于 Hieff® qPCR SYBR Green Master Mix (No Rox)，若更换其他试剂，建议参考相关资料适当调整试验。

  1. 在 PCR 板上划分出标记（下图中蓝线），方便加样；

尽管没有证据证明油墨在高温下挥发，长期可能损坏实时荧光定量 PCR 仪；但仍建议标记不要超过 PCR 封板膜区域。

  1. 将离心管放置在冰上，按下列组分预混 Hieff® qPCR SYBR Green Master Mix、Forward Primer 和 Reverse Primer，充分混匀，掌上型迷你离心机聚集后备用；
组分 用量（μL） 终浓度
Hieff® qPCR SYBR Green Master Mix (No Rox) \(10n\)* 1X
Forward Primer (10 μM) \(0.4n\)* 0.2 μM
Reverse Primer (10 μM) \(0.4n\)* 0.2 μM

*\(n\) 按 1.1–1.15 倍实际孔数计算，并向上取整；如上图中每个基因有 48 孔，则 \(n=[48×1.1]=53\)。

  1. 模板稀释：将 cDNA 放置在冰上，按相同比例使用无菌超纯水稀释各 cDNA 原液，建议 5–10 倍稀释，最佳模板加入量以扩增得到的 Ct 值在 20–30 个循环为宜；

  2. 将 PCR 板放置在冰上，每孔按下列组分配制 PCR 反应液：

组分 用量（μL）
Hieff® qPCR SYBR Green Master Mix (No Rox) + Primer 预混液 10.8
稀释后的 cDNA 9.2

相当于

组分 用量（μL） 终浓度
Hieff® qPCR SYBR Green Master Mix (No Rox) 10 1X
Forward Primer (10 μM) 0.4 0.2 μM
Reverse Primer (10 μM) 0.4 0.2 μM
cDNA V -
无菌超纯水 to 20 -
总体积 20 -
  • 引物浓度：通常引物终浓度为 0.2 μM，也可以根据情况在 0.1–1.0 μM 之间进行调整。
  • 模板浓度：如模板类型为未稀释 cDNA 原液，使用体积不应超过 qPCR 反应总体积的 1/10。
  • 模板稀释：cDNA 原液建议 5–10 倍稀释，最佳模板加入量以扩增得到的 Ct 值在 20–30 个循环为好。
  • 建议在 20 μL 反应液中使用相当于 10 pg–100 ng Total RNA 量的 cDNA 为模板。

  1. 轻磕 PCR 板，使液体尽可能聚于孔底，小心使用 PCR 封板膜封板；

  2. 充分混匀后（避免剧烈震荡产生过多气泡），使用微孔板离心机聚集反应液，在实时荧光定量 PCR 仪上按下列条件扩增：

步骤 温度 时间 循环数
预变性 95 °C 3 min 1
变性 95 °C 10 s 40*
退火/延伸 60 °C 30 s 40*
熔解曲线阶段 仪器默认设置 仪器默认设置 1

*95 °C 变性 10 s 后 60 °C 退火/延伸 30 s 为一个循环，共循环 40 次。

少量气泡在预变性高温阶段破裂，因此并不影响检测。

References

  1. PrimeScript™ RT Master Mix (Perfect Real Time) Product Manual

  2. Hieff® qPCR SYBR Green Master Mix (No Rox) 产品说明书