RNA 定量和储存

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RNA 定量

通常使用 NanoDrop 微量分光光度计对总 RNA 进行质量控制和定量，不同厂家设备具体操作可能略有不同，大致操作流程如下：

  1. 根据样品选择正确的检测项目，如 双链 DNA、单链 DNA 或 RNA 等；

  2. 无尘纸擦拭上下基座，取 1–2 μL 空白检测溶液至基座，降下检测臂，进行基线校正；

  3. 无尘纸擦拭上下基座，取 1–2 μL 均匀样品至基座，降下检测臂，进行检测；

  4. 读取检测结果。

核酸测量中不同吸光度含义

  • 260 nm：DNA（和 RNA）的吸收谱在 260 nm 最大，核酸的吸收值几乎常用 A260 或 OD260 表示。对于双链 DNA，OD260 为 1.0 相当于浓度为 50 mg/mL；对于单链 RNA，OD260 为 1.0 相当于浓度为 40 μg/mL（40 ng/μL）。因此 RNA 浓度可按下式计算：

\[ RNA\ 样品浓度\ (ng/μL) = A260 × 40 × 稀释倍数 \]

  • 230 nm：胍盐、苯氧基离子、硫氰酸酯及其他经常用于核酸制备的化合物在该波长下具有强吸收。
  • 280 nm：芳香族氨基酸色氨酸和酪氨酸在该波长下具有强吸收。多年以来，260 nm 与 280 nm 的吸光度比值一直用于检测核酸中是否污染了蛋白质。这项测定尽管十分普遍，但却值得怀疑。这个方法需追溯到 Warburg 和 Christian（1942）的研究，他们发现 OD260/OD280 比值是核酸中是否污染蛋白质的很好的指示。但事实上这并不是真的！DNA 在 260 nm 的吸收很强，只有在被大量蛋白质污染的条件下才会引起两个波长下吸光度比值的显著变化。
  • 320 nm：在高波长下的吸收一般是由光散射造成的，可用于指示核酸制备过程中特定物质引起的浊度。

纯的 RNA 的 OD260/OD280 值接近 2.0。如果有明显的蛋白质或酚污染，OD260/OD280 比小于 2.0，另一个比值 OD260/OD230 可用于评估有机化合物或高离液盐（chaotropic salt）的污染水平，它们在波长 230 nm 处有强烈吸收，导致低 OD260/OD230。理想情况下，提取 RNA 的 OD260/OD230 的比例应接近 2.0。下表是核酸理想吸光度比值范围：

Table 1. 核酸理想吸光度比值范围

DNA RNA
OD260/OD280 ~1.8 (1.6–1.8)* ~2.0 (1.7–2.0)*
OD260/OD230 ~2.0 ~2.0

*表示可接受范围

此外，OD260/OD280 比值依赖于 pH 和离子强度。随着 pH 的增加，A280 降低，但 A260 不受影响，从而 OD260/OD280 的比值增加。因为纯水（如蒸馏水、MilliQ 或无 RNase/DNase 水）pH 为酸性，如果使用它们溶解 RNA，OD260/OD280 的比值可能偏低。因此，为了准确的可重复的读数，最好使用缓冲液如 TE（pH 8.0）作为稀释剂和空白对照。

Table 2. 异常吸光度比值可能原因

样品类型 吸光度比值 可能原因
DNA OD260/OD280 > 1.9 RNA污染或部分DNA降解成寡聚核苷酸或单核苷酸（dNTPs），当OD260/OD280 > 2.2时，DNA基本上已完全降解。
DNA OD260/OD280 < 1.6 蛋白质残留或其他苯环物质（如酚类）造成的吸收。
DNA OD260/OD230 < 2.0 乙醇、碳水化合物等在230nm处有吸收。
RNA OD260/OD280 < 1.7 蛋白质或酚类在280nm处有吸收峰。
RNA OD260/OD280 > 2.0 RNA降解，造成260nm处的吸收增强。
RNA OD260/OD230 < 2.0 残留的异硫氰酸胍、β-巯基乙醇、乙醇等在230nm处有吸收。

  Table 3. Effect of common impurities of nucleic acid samples in purity ratio.

Impurities OD260/OD280 ratio OD260/OD230 ratio DNA/RNA concentration Comments
Proteins Slightly reduced Strongly reduced Weakly affected Effect of protein contamination on purity ratio depends on NA concentration
EDTA Unchanged Decreased Unchanged Its effect on the ratio decreases with high DNA concentrations
Organic solvents
Phenol		 Slightly reduced Slightly reduced Strongly affected Shift of 260 nm peak towards 270 nm at high concentrations
TRIzol™/Chloroforms Slightly reduced Strongly reduced Strongly affected Effect on OD260/OD230 ratio will be enhanced by the presence of GTC
Ethanol Unchanged Slightly reduced Unchanged Not clearly distinguished in absorbance spectra
Detergents
Triton™ X-100		 Reduced Strongly reduced Strongly affected Detected even at very low concentrations
Tween® 20 Unchanged Strongly reduced Weakly affected Only detected at high concentrations
Salts
GTC*		 Slightly reduced Reduced Unchanged Very little impact on downstream applications
GuHCl** Mostly unchanged Reduced Unchanged Only detected at high concentrations

* GTC = guanidine thiocyanate; **GuHCl = guanidine hydrochloride

RNA 的储存

提取 RNA 或重复使用样品时，可能会引入少量的 RNase 污染。正确的存储可以减少 RNase 污染和随之而来的样品降解。以下是几种可供选择的用于存储纯化 RNA 的方法：

用水性缓冲液溶解沉淀并存储于 -80 °C

常用缓冲液包括：

  • TE（10 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L EDTA，pH 7.0）
  • 含 SDS（0.1%～0.5%）的 TE（pH 7.6）
  • 含有 0.1 mmol/L EDTA（pH 7.5）的 DEPC 处理水
  • 商品化的 RNA 储存液（如 RNA 储存液，Ambion）

RNA 在 -80 °C 下可稳定保存 1 年。EDTA 是一种镁和其他金属离子的螯合剂，可以避免这些金属离子对 RNA 的非特异性降解；使用 EDTA 溶液要保证无 RNase。SDS 是一种核酸酶抑制剂；在用 RNA 作为模板之前，如用于引物延伸反应、反转录或体外翻译时，应用氯仿抽提和标准乙醇沉淀法去除 SDS。

用盐/乙醇混悬液（salt/ethanol slurry）在 -80 °C 下储存

将 RNA 按标准沉淀步骤沉淀，即盐（1/10 体积的 3 mol/L 乙酸钠）和乙醇（2 倍体积的 100% 乙醇）在 -80 °C 下存储该混合物，不需要通过离心沉淀 RNA。低 pH、高乙醇含量及低温的结合将稳定 RNA 并抑制酶活性，这是长期储存 RNA 的首选方法。当需要时，可以使用自动移液装置回收 RNA 样品。然而，由于沉淀的 RNA 是块状并有黏性，黏在一次性吸头表面上会造成部分损失，导致 RNA 的回收量损失。可以离心得到 RNA 沉淀，并溶解在水溶性缓冲液，然后再吸取。

用去离子甲酰胺溶解沉淀并储存于 -20 °C

在这种条件下，RNA 至少可以稳定保存 1 年（Chomczynski 1992）。甲酰胺提供了稳定的化学环境，可保护 RNA 不被 RNA 酶降解。甲酰胺可以很快溶解纯的无盐 RNA，浓度可大于 4 mg/mL，这样浓度的 RNA 样品可以直接进行凝胶电泳、RT-PCR 或 RNase 保护分析，既省时又避免了潜在因素的降解。如果需要，用 4 倍体积的乙醇进行沉淀，如 Chomczynski（1992）所述，或用 0.2 mol/L NaCl 4 倍稀释甲酰胺，然后加入常规 2 倍体积的乙醇（Nadin-Davis and Mezl 1982）可以回收溶于甲酰胺溶液中的 RNA。

当从存储状态回收 RNA 样品时，最好是在冰上解冻样品，以避免被 RNase 降解。此外建议按使用量分装 RNA，这样可避免反复冻融对 RNA 的损伤，并可防止 RNase 污染。

References

  1. (美)M.R.格林(Michael R. Green) (美)J. 萨姆布鲁克(Joseph.Sambrook) 主编, 贺福初 译. 分子克隆实验指南(原书第四版)(精装上下册)[M]. 分子克隆实验指南（原书第四版）（精装上下册）, 2017.

  2. 准备一份好的核酸模板，真的非常有必要 (yeasen.com)

  3. When It’s All About Quality: The Importance of Purity and Integrity Estimation (bioecho.com)