两步法 RT-qPCR

发表于 Waline：

反转录

材料

  • 已测定浓度的 Total RNA 样品
  • PrimeScript™ RT Master Mix (Perfect Real Time)

It contains a 5X pre-mixed reagent containing all of the components needed for quantitative RT-PCR reverse transcription (PrimeScript RTase, RNase Inhibitor, Random 6 mers, Oligo dT Primer, dNTP Mixture, and reaction buffer), and a reaction can be started simply by adding template RNA and water.

  • RNase Free dH2O

设备

  • 盛有冰的容器
  • 微量离心管（0.2 mL）
  • 涡旋混匀仪
  • 掌上型迷你离心机
  • 可编程所需扩增程序的热循环仪

方法

  1. 按下列组分在冰上配制 RT 反应液：
试剂 使用量（μL） 终浓度
5X PrimeScript RT Master Mix（Perfect Real Time） 4 1X
Total RNA V
RNase Free dH2O 16 - V
总体积 20

其中：

\[ V = \frac{1000}{c} \]

  • V：Total RNA 使用量，μL；
  • c：Total RNA 浓度，ng/μL；
  • 1000：指 20 μL 反应体系可最大使用 1000 ng 的 Total RNA。
  1. 轻柔混匀后，掌上型迷你离心机聚集反应液后，进行反转录反应，条件如下：
温度 时间 备注
37 °C 15 min 反转录反应
85 °C 5 s 反转录酶的失活反应
4 °C

反转录产物为单链 cDNA，-20 °C 保存，减少反复冻融次数，可以使用一年以上。

Real Time PCR

材料

  • Hieff® qPCR SYBR Green Master Mix (No Rox)

Hieff® qPCR SYBR Green Master Mix (No Rox) 是 2X 实时定量 PCR 扩增的预混合溶液。Mix 中含有热启动 Hieff® DNA Polymerase、SYBR Green I、dNTPs、Mg2+。使用时，仅需在扩增体系中加入模板和引物即可进行实时荧光定量 PCR，大大简化操作过程，降低污染几率。

  • cDNA
  • 各 Forward Primer 和 Reverse Primer（包括目的基因和至少一个内参基因）

设备

  • 盛有冰的容器
  • 荧光定量 PCR 板
  • 微孔板离心机
  • 实时荧光定量 PCR 仪

方法

  1. 在冰上按下列组分配制 PCR 反应液：
组分 用量（μL） 终浓度
Hieff® qPCR SYBR Green Master Mix (No Rox) 10 1X
Forward Primer (10 μM) 0.4 0.2 μM
Reverse Primer (10 μM) 0.4 0.2 μM
cDNA V -
无菌超纯水 9.2 - V -
总体积 20 -

Tips: 可分别将 Hieff® qPCR SYBR Green Master Mix、Forward Primer 和 Reverse Primer 预混，cDNA 和无菌超纯水预混后，再分别加到荧光定量 PCR 板中，减少移液误差。

  • 使用前务必充分混匀，避免剧烈震荡产生过多气泡。
  • 引物浓度：通常引物终浓度为 0.2 μM，也可以根据情况在 0.1–1.0 μM 之间进行调整。
  • 模板浓度：如模板类型为未稀释 cDNA 原液，使用体积不应超过 qPCR 反应总体积的 1/10。
  • 模板稀释：cDNA 原液建议 5–10 倍稀释，最佳模板加入量以扩增得到的 Ct 值在 20–30 个循环为好。
  • 建议在 20 μL 反应液中使用相当于 10 pg–100 ng Total RNA 量的 cDNA 为模板。
  1. 充分混匀后（避免剧烈震荡产生过多气泡），按下列条件扩增：
步骤 温度 时间 循环数
预变性 95 °C 3 min 1
变性 95 °C 10 s 40*
退火/延伸 60 °C 30 s 40*
熔解曲线阶段 仪器默认设置 仪器默认设置 1

*95 °C 变性 10 s 后 60 °C 退火/延伸 30 s 为一个循环，共循环 40 次。

结果分析

标准扩增曲线为 S 型，如下图：

PCR 前期，目的 DNA 以指数形式扩增，这一扩增时期称为指数期（Exponential phase）；PCR 后期，由于引物和 dNTP 等反应底物的减少，目的 DNA 片段扩增的速度变慢，直至停止，这一扩增时期称为平台期（Plateau phase）。qPCR 过程中，荧光值随着目的 DNA 的扩增而增加，当荧光值达到阈值时的循环数称为 Ct 值，Ct 值越小，说明目的 DNA 的初始浓度越大。

  • 反应结束后需要确认扩增曲线及熔解曲线，标准扩增曲线为 S 型，熔解曲线呈单峰。

熔解曲线是 SYBR Green 法 qPCR 实验中评价扩增特异性的关键指标，只有熔解曲线呈单峰，才能说明 qPCR 是特异扩增。一般产物的熔解温度 Tm 值（熔解曲线的峰）在 75–90 °C，如果在较低温度有一个小峰，可能是引物二聚体；如果 Tm 值在 90 °C 以上，说明目的片段 GC 含量过高，或者扩增长度过长。另外，如果 cDNA 样本中有 gDNA 残余，且 gDNA 也发生扩增时，也会造成双峰。可以将 qPCR 产物进行凝胶电泳，和熔解曲线的结果相互印证。一般熔解曲线中有几个峰，电泳中泳道里就有几条带。

  • Ct 值介于 20–30 之间时，定量分析最准确；Ct 值小于 10 时，需要将稀释模板后，重新进行实验；Ct 值介于 30–35 之间时，需要提高模板浓度，或者增大反应体系的体积，以提高扩增效率，保证结果分析的准确性；Ct 值大于 35 时，检测结果无法定量分析基因的表达量，但可用于定性分析。
  • 定量实验至少需要三个生物学重复。所有复孔间的差别应该在 0.5 Ct 内。在 35 个循环以后，Ct 值变化较大，定量结果可能不太可靠。

2-ΔΔCt 法计算目的基因相对表达量

假设计算目的基因（Target）在给药组（Treatment）中相对于模型组（Control）的表达量，其中内参基因（References）在总 RNA 中表达稳定。计算公式如下：

$$

Ct = Ct_{Target} - Ct_{Reference} $$

\[ \Delta\Delta Ct = \Delta Ct_{Treatment} - \Delta Ct_{Control} \]

\[ Relative\ Expression = 2^{-\Delta\Delta Ct} \]

内参基因（Reference gene），又称看家基因，这类基因在不同的样本中表达量比较稳定，如 β-actin、tubilin、16s rRNA、GAPDH 等。在相对定量中，内参基因可以校准不同样本间总 RNA 量的差异。

References

  1. PrimeScript™ RT Master Mix (Perfect Real Time) Product Manual

  2. Hieff® qPCR SYBR Green Master Mix (No Rox) 产品说明书

  3. 基因表达研究⸺qPCR实验指南)