从哺乳动物的细胞和组织中提取总 RNA

发表于 2024-09-15 Waline：

材料

悬浮或单层生长的细胞样品或组织样品
氯仿或溴氯丙烷（CAS 号：109-70-6）

溴氯丙烷是一种可取的氯仿替代物，因为它毒性更小且不易挥发。此外，溴氯丙烷可以提供更好的液相分离，从而更好地从总 RNA 中去除基因组 DNA，获得更纯的 RNA。

乙醇（75%），用焦碳酸二乙酯（DEPC）处理的水配制
糖原（20 mg/mL 储存液）（可选）
异丙醇
单相裂解试剂（如 TRIzol）
磷酸盐缓冲液（PBS）（1X）
无 RNase 的水

设备

Glass-Teflon 或高效匀浆器（如 Polytron，或 Tekmar's TISSUMIZER 或类似设备）

方法

除另有说明外，该过程在室温下（15–30 °C）进行，并且试剂是在 15–30 °C 放置。

样品匀浆

样品的体积应不超过用于匀浆的单相裂解试剂体积的 10%。

准备并匀浆单层细胞，悬浮培养物或组织样本。

贴壁生长的单层细胞

移除培养基，并用 1–2 mL 冰冷的 PBS 漂洗细胞一次。
移除 PBS，直接在培养皿中裂解细胞，每 10 cm² 培养皿加入 1 mL 的单相裂解试剂并用细胞刮刀刮取。

单相裂解试剂的添加量基于培养皿的面积而不是细胞数量（10 cm²/mL）。单相裂解试剂不足可能导致提取的 RNA 有 DNA 污染。

用吸头吹打几次细胞裂解液，彻底混悬。
继续进行步骤 2。

样品可以储存在 -60–-70 °C 至少 1 个月。

悬浮生长的细胞

200–1900 g 室温在台式离心机中离心 5–10 min 收集细胞（1000–3000 r/min 在 Sorvall H1000 转子中）。
去除培养基，用冰冷的 PBS 重悬细胞。200–1900 g 离心 5 min 沉淀细胞。
每 5×10⁶–10×10⁶ 个细胞，加入 1 mL 的单相裂解试剂，重复吸打或通过注射器和针头抽吸裂解细胞。
继续进行步骤 2。

样品可以储存在 -60–-70 °C 下至少 1 个月。

组织

每 50–100 mg 组织用 1 mL 的单相裂解试剂匀浆组织样本，使用 glass–Teflon 或高效匀浆器匀浆。

对于蛋白质、脂肪、糖类或细胞外物质含量高的样品，如肌肉和脂肪组织，可以执行下述可选步骤；否则，请继续步骤 2。

样品可以储存在 -60–-70 °C 至少 1 个月。

匀浆后样品于 2–8 °C，12 000 g 离心 10 min，从组织匀浆液除去不溶物。

沉淀里包含细胞外膜、多糖类和高分子质量的 DNA，而上清液中包含 RNA。

从脂肪组织样本中去除脂肪收集顶层。
将澄清的匀浆溶液转移到新的管中。
请继续进行步骤 2。

样品可以储存在 -60–-70 °C 至少 1 个月。

相分离

孵育匀浆样品，室温 5 min，以完全解离核蛋白复合物。
每毫升初始匀化单相裂解试剂匀化样品加入 0.2 mL 氯仿。盖紧管盖，用力摇动试管 15 s，并在室温下孵育 2–3 min。

不要涡旋样品，因为它会导致 DNA 污染。

2–8 °C，12 000 g 离心 15 min。混合物分为下层酚-氯仿相、中间相和上层水相。RNA 仅存在于上层水相。

在这个方案，此步骤和步骤 7 中如果将离心时间增加到 30–60 min，也可使用最大速度 2600 g 的台式离心机。

小心地将上层水相转移到新的离心管中，注意不要扰动中间层。每毫升初始匀化单相裂解试剂可获得约 600 μL 水相。

如果需要分离 DNA 或蛋白质，请保留有机相。

水相的体积应该为在步骤 1 中使用的单相裂解试剂体积的 60%。虽然每毫升单相裂解试剂可以获取 600 μL 水相，为了防止 DNA 的污染，推荐只收回 500 μL。

分离 RNA

从水相中沉淀 RNA，每毫升初始单相裂解试剂加入 0.5 mL 的异丙醇。颠倒离心管几次混匀。在室温下孵育样品 10 min。

加入 1 μL 糖原（20 mg/mL）储存液使步骤 7 中形成的沉淀可见。

于 2–8 °C，不超过 12 000 g 离心 10 min，收集 RNA 沉淀。

Tips: 离心管在离心机中按同一个朝向向心放置，便于观察 RNA 沉淀位置。

RNA 沉淀在离心之前通常是不可见的，离心后在试管底部的一侧形成凝胶样沉淀。

弃去上清液，并用吸头完全去除残留液体。
用 75% 乙醇洗涤一次 RNA 沉淀，加入至少 1 mL 75% 乙醇，涡旋混合样品液，然后在 2–8 °C 以不超过 7500 g 离心 5 min。

Tips: 离心管在离心机中按同一个朝向向心放置，便于观察 RNA 沉淀位置。

在 75% 乙醇中的 RNA 沉淀存储在 2–8 °C 至少 1 周，或在 -5–-20 °C 存储至少 1 年。

完全去除乙醇，空气干燥或真空干燥 RNA 沉淀 5–10 min。

除去乙醇后，沉淀应该是半透明的，在干燥时，沉淀将变成透明凝胶体状。不要真空离心干燥 RNA。重要的是不要让 RNA 沉淀完全干燥，因为这将大大降低其溶解度。部分溶解的 RNA 样品 A260/A280 比值为 1.6。

用 20 μL 的无 RNase 水溶解 RNA，吸头反复吸打几次，然后在 55–60 °C 温育该溶液 10 min。

为了更好地溶解 RNA，可以使用加热到 40 °C 的无 RNase 水。RNA 也可溶于 100% 甲酰胺（去离子），可在 -20 °C 下储存 1 年。甲酰胺提供了一种稳定的化学环境，保护 RNA 不被 RNase 降解。

附 1：不同样品总 RNA 终浓度范围

按上述方法，不同样品获得的总 RNA 终浓度大致范围如下：

	每 mL 单相裂解液样品量	总 RNA 含量**	总 RNA 终浓度
贴壁生长的单层细胞	1.2 x 10⁶ Cells*	5–10 μg/10⁶	300–600 ng/μL
悬浮生长的细胞	5×10⁶–10×10⁶ Cells	5–10 μg/10⁶	1250–5000 ng/μL
组织	50–100 mg	4–7 μg/mg	10000–35000 ng/μL

*按 35 mm 培养皿或 6 孔培养板汇合时的细胞数为 1.2 x 10⁶ 个。

**总 RNA 的产率因组织或细胞来源而异，但一般而言，组织的初始产量为 4–7 μg/mg 初始组织或 5–10 μg/10⁶ 细胞。

***RNA 终浓度，按 20 μL 无 RNase 水溶解 75% 乙醇沉淀后的 RNA 计算。

References

(美)M.R.格林(Michael R. Green) (美)J. 萨姆布鲁克(Joseph.Sambrook) 主编, 贺福初译. 分子克隆实验指南(原书第四版)(精装上下册)[M]. 分子克隆实验指南（原书第四版）（精装上下册）, 2017.
细胞培养皿、培养板和培养瓶-赛默飞 | Thermo Fisher Scientific - CN